反义基因片段抑制胶质瘤细胞IGF-IR基因表达的研究

目的 探讨反义基因片段对胶质瘤细胞胰岛素样生长因子-I受体（IGF-IR）基因表达抑制作用的可行性。方法 应用RT-PCR技术和免疫细胞化学方法，并经图象分析以检测反义寡核苷酸作用后细胞IGF-IR基因的表达水平的变化。结果 反义寡核苷酸能有效地降低IGF-IRmRNA表达，并随着反义核苷酸浓度的增加，其mRNA水平逐渐减少。正义核酸组与空白对照组相比较，IGF-IRmRNA水平无显著性差异。免疫细胞化学方法和生物图像分析研究发现；反义核酸组细胞IGF-IR蛋白低表达或不表达，而空白对照组和正义核酸组细胞均呈高表达。结论 针对IGF-IR基因mRNA序列起始密码子及下游序列所设计的反义寡核苷酸能有效阻止mRNA的翻译功能，使其蛋白产物表达下调，达到封闭或减弱该基因表达的目的。     

多聚凝胶介导IGF-IR反义寡核苷酸治疗体内胶质瘤的实验研究

目的探讨反义寡核苷酸阻断IGF-IR基因表达对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用。方法首先建立胶质瘤裸鼠移植模型,随机分为4组:空白对照组、多聚凝胶组、正义核酸组和反义核酸组,反义核酸组在瘤内注射多聚凝胶包裹的反义寡核苷酸,其他每组均作相应的瘤内注射处理。利用多聚凝胶缓释反义寡核苷酸的作用,观察肿瘤的抑制情况、肿瘤病理和IGF-IR表达结果。结果反义核酸组用反义核苷酸开始治疗后的第1周、第2周和第3周,肿瘤的生长速度明显减慢,与空白对照组相比,抑制率分别为65.2%、76.38%和69.6%;而多聚凝胶组和正义核酸组肿瘤生长速度与空白对照组相比无明显差异,其抑制率在各时间点均低于10%。肿瘤的组织病理发现多聚凝胶组、正义核酸组如同空白对照组(野生型),肿瘤细胞密集分布,呈明显的恶性增殖表现,而反义核酸组肿瘤细胞稀疏,可见部分细胞呈凋亡改变,细胞染色质浓聚边缘化。在空白对照组(野生型)、多聚凝胶组和正义核酸组IGF-IR蛋白均呈高表达,而反义核酸组IGF-IR的表达明显减弱。结论IGF-IR的反义寡核苷酸对体内胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,并能诱导部分肿瘤细胞凋亡。因此,IGF-IR可作为胶质瘤基因治疗的靶。     

PCNA反义脱氧寡核苷酸体外抑制BT325细胞增殖的实验研究

目的 观察增殖细胞核抗原(PCNA)基因反义脱氧寡核苷酸对人多形性胶质母细胞瘤细胞增殖的影响。方法 采用人工合成的PCNA反义和正义脱氧寡核苷酸经阳离子脂质体包裹后转染人多形性胶质母细胞瘤细胞BT325。用MTT比色法检测转染后瘤细胞的生长抑制率;~3H-TdR法检测细胞DNA合成速率;流式细胞仪检测细胞周期分布;RT-PCR检测PCNA mRNA表达;免疫组化方法检测PCNA蛋白表达水平。结果 PCNA反义寡核苷酸可明显抑制BT325细胞的生长;明显减慢其DNA合成速率,阻滞细胞由GO/G1期→S期,PCNA mRNA及其蛋白质表达也同时受到抑制。抑制效应在转染后12h即出现,24h达到高峰,48h后逐渐减弱。抑制作用随反义寡核苷酸浓度的升高而增强,0.8μM PCNA反义寡核苷酸的细胞生长抑制率达84.6％。同样浓度的正义寡核苷酸和脂质体则无明显的细胞生长抑制作用。结论 PCNA反义寡核苷酸在体外能明显抑制人脑多形性胶质母细胞瘤细胞BT325生长、DNA合成、mRNA和PCNA蛋白表达。PCNA基因可望成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

反义基因片段抑制人胶质瘤u251增殖和侵袭的体外研究

目的:研究反义PCNA及uPAR基因片段对胶质瘤细胞株u2 5 1体外增殖和侵袭能力的影响。方法:用脂质体介导寡核苷酸转染培养的u2 5 1胶质瘤细胞,RT PCR、原位杂交和免疫组化等方法分别检测相关基因和蛋白的表达,MTT比色法研究对胶质瘤细胞增殖能力的影响,Boyden小室模型研究对细胞侵袭能力的影响。结果:PCNA及uPAR反义寡核苷酸作用u2 5 1胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱,细胞的体外增殖和侵袭能力明显被抑制。结论:反义PCNA及uPAR寡核苷酸片段能有效地抑制胶质瘤细胞的u2 5 1相关基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭能力。     

反义IGF-IR基因片段对裸鼠胶质瘤形成的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-I受体(IGF—IR)的反义基因片段对裸鼠胶质瘤的形成及其病理的影响。方法 体外用反义IGF—IR基因片段孵育胶质瘤细胞，并接种裸鼠体内，了解其肿瘤形成能力及其肿瘤组织学和IGF—IR的表达：结果 野生型C6细胞和正义寡核苷酸孵育的C6细胞在BALB／c裸鼠体内形成肿瘤的潜伏期均为4d，而经反义寡核苷酸孵育的C6细胞在裸鼠体内形成肿瘤的潜伏期为11～12d，肿瘤形成的潜伏期明显延长，肿瘤的生长得到抑制。肿瘤形成7d时，研究发现正义核酸组与野生组肿瘤病理组织学是一致的，且IGF—IR均呈高表达，反义核酸组肿瘤细胞变得稀疏，而且可见部分肿瘤细胞核固缩，染色质凝聚边缘化，甚至有细胞出现核碎裂等凋亡征象，IGF—IR表达明显减少。而在肿瘤形成的25d时，反义核酸组胶质瘤的病理表现和IGF—IR蛋白的表达与对照组和正义核酸组无明显差异。结论反义IGF—IR基因片段能抑制裸鼠胶质瘤的形成能力，但逃脱反义IGF—IR基因片段封闭的肿瘤细胞经过体内的增殖可形成肿瘤。     

bFGF反义寡核苷酸诱导胶质瘤细胞的凋亡

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)反义寡核苷酸对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用。方法:将硫代磷酸修饰的bFGF反义寡核苷酸转染人脑胶质瘤细胞系TJ905,采用原位细胞死亡检测方法和电子显微镜,观察胶质瘤细胞凋亡的形态学变化,并用免疫组化法检测了增殖细胞核抗原(PCNA)的变化。结果:胶质瘤细胞呈现凋亡的形态改变,PCNA的表达明显降低。结论:bFGF反义寡核苷酸可诱导胶质瘤细胞的凋亡,抑制胶质瘤细胞的增殖。bFGF基因可作为反义治疗的目的基因。     

端粒酶反转录酶在长骨造釉细胞瘤中的表达

目的：端粒酶反转录酶作为端粒酶蛋白的主要组分，被称为端粒酶活性作用的限速因子，在细胞增生过程中起重要作用。观察长骨造釉细胞瘤中端粒酶反转录酶的表达及其反义寡核苷酸对其表达和细胞增生的抑制作用。 方法：实验于2006-02/2007-04在沈阳市第四人民医院完成。体外培养长骨造釉细胞瘤细胞，在24，48，72 h 后采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法作端粒酶反转录酶免疫组织化学检测；将2.5，5.0 μmol/L 和10.0 μmol/L 不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸分别作用于体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞，无寡核苷酸混合液的DMEM液作空白对照，采用免疫组织化学方法检测端粒酶反转录酶的表达；四甲基偶氮唑盐比色法检测在不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸作用下,长骨造釉细胞瘤细胞生长活性及其生长抑制率。 结果：①体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞可表达端粒酶反转录酶，在5.0，10.0 μmol/L 反义寡核苷酸作用下，端粒酶反转录酶的表达明显受抑制，与空白对照组比较，差异有显著性意义（P < 0.01）。②端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能明显抑制长骨造釉细胞瘤细胞增生活性，并呈剂量依赖性。　 结论：一定浓度端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能序列特异性地抑制长骨造釉细胞瘤细胞端粒酶反转录酶表达和增生活性。     

尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体的反义基因片断抑制胶质瘤u25i细胞的体外侵袭

目的：研究尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体（uPAR）的反义基因片断对胶质瘤细胞株u251体外侵袭能力的影响。方法：脂质体介导寡核苷酸转染培养的u251胶质瘤细胞，用RT—PCR、原位杂交和免疫组化方法分别检测相关基因和蛋白的表达，Boyden小室模型研究对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果：uPAR反义寡核苷酸作用u251胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱，细胞的体外侵袭能力被明显抑制。结论：uPAR的反义寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞u251相关基因的表达，并能抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力。     

端粒酶反义寡核苷酸治疗脑胶质瘤实验研究

目的研究端粒酶反义寡核苷酸对胶质瘤细胞端粒酶活性、细胞增殖和细胞凋亡的影响,为以端粒酶为靶点治疗脑胶质瘤提供理论和实验依据。方法以端粒酶催化亚单位基因(hTERT)为靶点设计合成硫代磷酸化反义寡核苷酸(PS-ASODN),经脂质体(lipofectin)包裹转染胶质瘤细胞,每隔24h取样。采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测PS-ASODN对细胞生长增殖的影响;用端粒重复序列扩增-聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定(TRAP-PCR-ELISA)法检测端粒酶活性的变化;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的改变。结果PS-ASODN实验组与正义组、错义组及空白对照组相比较,48h后细胞生长增殖受抑制,端粒酶活性降低(P<0.05),72h时,差异有高度显著性(P<0.01);实验组对细胞凋亡有显著的促进作用,细胞多阻滞于G2/M期。其作用具有序列选择的特异性,在一定的时间范围内,呈时间依赖性。结论端粒酶反义寡核苷酸能够有效地抑制胶质瘤细胞的生长而促进其凋亡,具有较好的临床应用前景。     

尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体的反义基因片断抑制胶质瘤u251细胞的体外侵袭

目的:研究尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体(uPAR)的反义基因片断对胶质瘤细胞株u251体外侵袭能力的影响。方法:脂质体介导寡核苷酸转染培养的u251胶质瘤细胞,用RT-PCR、原位杂交和免疫组化方法分别检测相关基因和蛋白的表达,Boyden小室模型研究对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果:uPAR反义寡核苷酸作用u251胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱,细胞的体外侵袭能力被明显抑制。结论:uPAR的反义寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞u251相关基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力。     

反义寡核苷酸逆转大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的实验研究

目的探讨针对多药耐药基因(MDR-1)上特异位点的反义寡核苷酸对体外培养的大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的逆转作用。方法根据MDR-1基因的碱基序列设计合成硫代修饰的寡核苷酸,通过阳离子脂质体介导转染胶质瘤耐药细胞,应用流式细胞仪、RT-PCR等方法,对转染后的耐药细胞进行P-170、MDR-1mRNA水平的检测;用MTT法对转染后的细胞进行化疗药物敏感性试验,评价寡核苷酸对多药耐药性的逆转效果。结果流式细胞结果显示转染后胶质瘤耐药细胞P-170表达明显低于转染前(P<0.05);RT-PCR可见转染后细胞的MDR-1mRNA水平减低;药物敏感性试验显示反义寡核苷酸转染后胶质瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性增强(P<0.05),含有脂质体的转染体系组对化疗药物的敏感性显著高于不含脂质体的转染体系组(P<0.01)。结论特异序列的反义寡核苷酸能够明显抑制大鼠胶质瘤细胞的P-170表达和减低MDR-1mRNA水平,进而对胶质瘤细胞的多药耐药性产生明显的逆转作用;应用阳离子脂质体作为转染载体可显著提高转染效率。     

反义miR-21抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖的体外研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制U251人脑胶质瘤细胞株增殖能力的效果和机制.方法 脂质体介导转染反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)下调U251人脑胶质瘤细胞株miR-21的表达.使用实时定量PCR和原位杂交法鉴定转染后U251细胞miB-21表达水平下调;MTY法评价AS-miR-21抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布和凋亡;采用细胞免疫荧光技术(PCNA、CyelinD1、Bcl-2、PTEN和Septin-7)评价转染后U251细胞肿瘤生物学性状改变.结果 MTT结果显示AS-miR-21转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组与无义寡核苷酸(F=78.926,P=0.000)组;实时定量PCR法:AS-miR-21转染组miR-21表达下调为对照组0.042±0.012;LNA-miR-21原位杂交显示AS-miR-21转染组miR-21表达水平较对照组与无义寡核苷酸组下调;流式细胞术检测可见AS-miR-21转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞(X2=14.160,P=0.007)且凋亡比例高于对照组与无义寡核苷酸组(F=23341.25,P=0.000);细胞免疫荧光法表明AS-miR-21治疗后U251细胞PCNA、CyclinD1、Bcl-2表达下调,PrEN、Septin-7表达上调.结论 以miR-21作为靶点抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长结果肯定,miR-21可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

铜绿假单胞菌制剂对大鼠C6胶质瘤细胞作用的体外机制研究

[摘要] 目的 初步探讨铜绿假单胞菌制剂（PA-MSHA）对体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制机制。方法 体外培养大鼠C6胶质瘤细胞, MTT比色法测定不同时间、不同浓度PA-MSHA对C6胶质瘤细胞的增殖抑制率。Hochest 33258染色,荧光显微镜下检测细胞凋亡,流式细胞仪检测PA-MSHA对C6细胞周期的影响。结果MTT比色法结果提示,细胞生长抑制率与药物作用时间和剂量正相关。24小时和48小时IC50值分别为(5.80±1.79)× 108cfu/ml和(3.90±2.14) × 108cfu/ml。Hochest33258染色可见明显的细胞凋亡形态学改变,流式细胞仪检测,药物作用组可见典型的亚二倍体峰即凋亡峰（AP）,且随浓度加大S期比例明显增多。 结论 铜绿假单胞菌(PA-MSHA)制剂对体外培养的C6胶质瘤细胞具有增殖抑制作用,且呈时间剂量依赖性。其机制可能与诱导细胞凋亡及S期阻滞有关。     

骨髓基质干细胞移植对大鼠胶质瘤局部微环境的影响

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脑胶质瘤模型大鼠(荷瘤大鼠)胶质瘤的影响。方法:观察BMSCs培养上清液对C6胶质瘤细胞增殖活性、细胞周期的影响。观察脑内移植BMSCs对胶质瘤核增殖抗原(PCNA)表达阳性率、脑内胶质瘤微血管计数的影响及荷瘤鼠生存期的改变。结果:BMSCs培养上清液对胶质瘤细胞增殖没有明显的影响;BMSCs可抑制肿瘤边缘及卫星灶的肿瘤增殖,对肿瘤内部的细胞增殖没有明显影响。移植BMSCs后肿瘤边缘及卫星灶的微血管计数未见明显改变。移植BMSCs后的荷瘤大鼠脑内胶质瘤水肿有所减轻。结论:BMSCs移植可轻度抑制荷瘤鼠脑内胶质瘤细胞的增殖。     

血管内皮生长因子反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用的研究

目的探讨VEGF反义RNA对C6鼠胶质瘤细胞体外作用。方法用Lipofectamine介导的方法将VEGF反义eDNA转染入C6鼠胶质瘤细胞系,观察其对细胞增殖和凋亡的影响。结果在体外VEGF反义RNA可有效抑制C6鼠胶质瘤细胞内源性VEGFmRNA和VEGF蛋白的产生,但对细胞增殖和凋亡无明显影响。结论采用VEGF反义RNA可能成为抗血管形成肿瘤治疗的新策略之一。