霉酚酸对乙型肝炎病毒复制的体外实验观察

目的探讨霉酚酸的体外抗乙型肝炎病毒作用。方法以HepG2．2．15为细胞模型，加入不同剂量的霉酚酸或拉米夫定，或霉酚酸加拉米夫定共培养，于第3、6、9天收集培养上清液行HBsAg定量检测；收集细胞提取总RNA，行逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及荧光实时定量PCR测细胞内HBVmRNA水平。结果霉酚酸单独应用时，浓度2～250μg／ml无明显抗乙型肝炎病毒作用，当浓度达1250μg／ml时，可使病毒mRNA水平下降1～2log，上清液中HBsAg滴度也有相应降低；拉米夫定5μ／ml可使病毒mRNA水平下降3～4log，上清液中HBsAg滴度也有相应降低；霉酚酸和拉米夫定合用时，可显著增强后者的抗乙型肝炎病毒作用，其中浓度10μg／ml时效果最明显。结论霉酚酸有体外抗乙型肝炎病毒作用，并可增强拉米夫定的体外抗乙型肝炎病毒作用。     

丁型肝炎病毒载体携带核酶在小鼠体内抑制乙型肝炎病毒复制

目的：研究用丁型肝炎病毒（HDV）作为载体携带乙型肝炎病毒（HBV）特异性的锤头状核酶所构建的重组体，在细胞体系及转染动物模型中对HBV基因表达和复制的影响。方法：将HDV-核酶重组体和HBV的共表达质粒转染Huh-7细胞以分析HDV-核酶重组体对HBV基因表达的影响；用小鼠尾静脉快速注射法将共表达质粒转染到小鼠体内，检测重组体在动物体内对HBV基因表达和复制的抑制作用。结果：转染细胞中，重组体对HBsAg的抑制与HDV重组位点和核酶靶位都有关；水压法注射的质粒在小鼠肝内得到表达，与对照相比重组HDV-核酶可有效抑制在肝和血清中HBV的基因表达以及复制。与细胞中的结果一致。结论：此项体内实验为进一步构建治疗性重组HDV病毒，发现靶向性抗病毒基因治疗手段奠定基础。     

特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒的体外消化作用

目的研究特异性脱氧核酶对丙型肝炎病毒（HCV）的体外消化作用。方法设计3个分别作用于HCV RNA 5＇非编码区（5＇ NCR）上157、168、173位点的脱氧核酶（DRz），分别命名为DRz1，DRz2,DRz3，均以5＇GGCTAGCTACAACGA-3’为脱氧核酶的催化活性中心，用内切酶XbaⅠ将含有HCV病毒序列的质粒pCMV/T7 NCRC,△Luc消化成线性，以此为模板体外转录出用α-^32PIUTP进行标记的靶HCV RNA。在37℃,PH7.5，Mg^2 10mmol/L等条件下，将HCV RNA（10nmol/L）与3个脱氧核酶（1μmol/L）分别混合进行切割反应，并进一步比较不同Mg^2浓度下DRz3的切割反应效率，反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影，应用凝胶成像分析仪评价脱氧核酶的切割效率。结果在设定反应条件下，3个脱氧核酶对HCV病毒均有切割活性，随着Mg^2浓度的增加，DRz3的切割活性增强，结论特异性脱氧核酶可有效切割HCV RNA 5＇NCR的RNA，且切割效率与Mg^2浓度呈正相关。     

商陆抗病毒蛋白体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP）是从美洲商陆种子或叶子中提取的一种碱性蛋白，具有抑制流感病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、HIV等多种病毒复制的作用。我们先前的研究发现：天然PAP种子体外直接作用于HepG2．2．15细胞，显示有较强的抗HBV作用，但在高剂量时对细胞有一定毒性。本研究旨在探讨PAP真核表达质粒体外对HBV的抑制作用。[第一段]     

HDV核酶对乙型肝炎病毒抑制作用的研究

目的研究HDV核酶在细胞内对乙型肝炎病毒(HBV)复制及其抗原表达的抑制作用。方法1)以HBV前基因组mRNA为靶基因,体外筛选出HDV核酶有效作用位点,构建HDV核酶并进行体外测活;2)分别选用tRNA-Val、U6和hCMV 3种真核启动子,重组构建HDV核酶真核表达载体ptVHRz、pSURz和pcDHRz,分别用3种载体转染HepG2.2.15细胞;3)用点杂交、ELISA和实时荧光定量PCR方法分别检测核酶在细胞内的表达及对HBV的抑制作用。结果在HBV C基因区筛选到一位点,所构建的HDV核酶在体外条件下对该位点能产生有效切割。3种核酶表达载体在细胞内均能高效表达,在转染48 h后,ptVHRz和pcDHRz对HBeAg的表达产生了明显的抑制作用,而对HBsAg没有抑制作用。三者对HBV的复制均未产生明显影响。结论HDV核酶在细胞内对HBV抗原的表达能产生特异性抑制作用,但未能有效抑制HBV的复制,对其原因需进一步深入研究。     

HBx-GFP DN突变子长期稳定表达抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒基因的表达

目的　探索和寻找更有效的乙型肝炎治疗新的靶点和新的治疗方法 ,研究其抗病毒基因表达作用。方法　运用基因工程技术 ,建立了HBx GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白 (GFP)的长期稳定表达细胞克隆 ,Northernblot检测细胞内的乙型肝炎病毒相关基因RNA转录 ,应用RIA检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达 ,观察对乙型肝炎病毒基因表达的影响。 结果所构建的X GFP突变子 ,Xwt,GFP质粒均能在 2 .2 .15细胞株中稳定高效表达并使细胞上清液中HBsAgHBeAg表达水平分别较 2 .2 .15组的 ( 10 1± 5.5)ng/ml、 ( 12 1± 8.6)ng/ml显著降低为平均( 7.6± 11.5)ng/ml、 ( 3 5± 3 .5)ng/ml (P <0 .0 1) ,细胞内的病毒 3 .5kb ,2 .1kb及 2 .4kb的RNA与各对照组比较均有显著降低 ,以 2 .1kb及 2 .4kb的mRNA下降最为显著。结论　乙型肝炎X基因DN突变子X GFP能显著抑制乙型肝炎病毒基因转录和S ,C基因的表达。提示 ,X基因亦是乙型肝炎治疗的一个靶基因     

乙型肝炎病毒转染及脂多糖刺激对HepG2细胞Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)转染对HepG2细胞表面Toll样受体(TLR)表达的影响及脂多糖(LPS)加重HBV转染致肝细胞损伤是否存在直接作用,进一步探讨乙型肝炎发病及重型化的发生机制。方法以不同浓度的LPS刺激HepG2细胞、HepG2．2．15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞),并以免疫细胞化学方法检测HepG2细胞及HepG2．2．15细胞表面TLR 2、4蛋白质表达情况,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR2、4 mRNA表达情况,用Abbot试剂检测HepG2．2．15细胞HgsAg和HgeAg表达情况,用流式细胞仪观察细胞生长周期及细胞凋亡情况。结果HepG2、HepG2．2．15细胞膜上均有TLR2、4蛋白质表达,免疫细胞化学染色在未加LPS及各浓度LPS刺激细胞均可见细胞膜有棕褐色着色,且随着LPS浓度增加,其着色强度增加;对0mg/L及10mg/L LPS诱导HepG2、HepG2．2．15细胞RNA进行RT-PCR扩增,其产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳均可见特异性条带,且10mg/L LPS诱导细胞TLR2和TLR4与分子量标准品的吸光度值比值明显高于0mg/L LPS诱导细胞扩增产物,分别为306．63±6．18对519．84±9．15和700．54±13．56对1116．62±37．67,F值分别为740．58和426．07,P值分别为0．01和0．02;流式细胞仪检测细胞周期发现HepG2绌胞及未经LPS诱导的HepG2．2．15未发生凋亡,各浓度LPS诱导的HepG2．2．15细胞均有细胞凋亡发生,且细胞凋亡率随着LPS浓度增加上升。结论LPS可能通过其与肝细胞膜上的TLR结合,而参与HBV转染后肝细胞损害及肝脏炎症重型化的发病机制。     

重型乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒全基因克隆及测序

目的建立重型乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA克隆并测序，从全基因水平分析HBV基因变异与重型乙型肝炎发病的关系。方法10例重型乙型肝炎患者血清提取HBV DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增HBV全基因。PCR产物构建到PUCm-T载体上，转化至大肠杆菌感受态DH-5α细胞，经酶切鉴定，获得含3．2Kb HBVDNA的重组克隆菌，全基因测序，分析各读码框核苷酸和氨基酸变化。结果4例成功构建HBV DNA克隆，并完成全基因测序。其中3例在前C区发生G1896A变异，产生一个终止密码子，导致HBeAg缺失；1例在C启动子区1762、1764双位点出现突变；有多处点突变及缺失变异分布于PreS2区及C区已知细胞毒T淋巴细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的细胞表位。结论该法可用于临床研究HBV病毒基因结构与重型乙型肝炎发病的关系，并为进一步研究其HBV基因功能奠定基础。     

pRevX-GFP DN突变体抑制HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 建立pRev X-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆，进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶，运用DN突变体技术，进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用。方法 运用基因工程技术，分别以逆转录病毒载体pRev TRE为载体，构建表达野生型HBV X蛋白，GFP蛋白和X与GFP融合的X-GFP融合蛋白的质粒，并分别导入乙型肝炎的转基因细胞株HepG2 2．2．15细胞(简称2．2．15细胞)中，并通过长期的潮霉素抗性选择，获得能稳定表达DN蛋白的2．2．15细胞克隆。应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA，Southern blot检测细胞内HBV复制中间体，以观察其表达对HBV病毒复制的影响。结果 所构建的pRev X-GFP突变体、pRev Xwt、pRev GFP质粒均能在2．2．15细胞株中稳定高效表达。PRev X-GFP高效表达后，能有效地抑制或阻断细胞内HBV核酸合成及其分泌入细胞上清液。定量聚合酶链反应结果显示，pRev X-GFP组的平均每毫升HBV DNA浓度较2．2．15细胞组分别下降1．0～1．81g值，对细胞内外dot blot结果进行图像分析，其灰度值仪为对照2．2．15细胞组的7．9％，Southern blot分析则发现，X基因DN突变体对HBV复制中间体rcDNA、ssDNA及dsDNA的形成有全面抑制作用。结论 pRev X-GFP DN突变体具有显著抑制HBV复制作用。初步证实X基因是HBV治疗的一个新靶点。针对X基因的治疗，有望为HBV治疗提供一些新的思路。     

肝癌患者乙型肝炎病毒基因变异的检测

目的了解肝癌患者HBV基因变异、机体免疫功能异常及肿瘤抑制基因P16蛋白失活的情况。方法运用基因芯片和核苷酸序列分析技术，对114份我院住院患者血清中HBVDNA（前C区1814、1896、BCP区1762、1764位）进行分析，流式细胞荧光染色检测患者外周血WBC中P16蛋白，流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，ELISA法检测IFN-γ、IL-4水平。结果慢性乙型肝炎组（41份）、乙型肝炎肝硬化组（37份）、肝癌组（36份）血清中的HBV总突变率为58．5％、75．6％和88．8％，肝组织中肝硬化、肝癌分别为75．0％和100％；慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝癌组患者外周血WBC中P16蛋白阳性率分别为（43．09±8．08）％、（30．54±10．61）％和（16．29±6．86）％，正常人为（76．57±6．07）％；肝癌患者CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞绝对数均明显低于健康对照组（t＇1=8．83、t＇2=6．59、t＇3=9．84，P〈0．05）；肝癌患者IFN-γ、IL-4水平明显低于健康者（t＇1=6．67、t＇2=3．82，P〈0．05）。结论肝癌患者中HBV基因变异普遍存在，机体免疫功能低下，外周血WBC中P16蛋白表达明显低。     

HBV复制子pHY106-BHBV转染HepG2细胞基因表达差异

目的:研究乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱的差异,分析参与胆固醇代谢的差异表达基因.方法:应用包含20 000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片ImaGene3.0检测乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱差异,并选择其中参与胆固醇代谢的表达下调基因7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶,用RT-PCR方法进行验证分析.结果:基因芯片筛选出差异表达的基因,其中包括转录因子、细胞周期素、细胞因子相关蛋白、糖脂类物质代谢相关酶及细胞信号转导相关因子等,RT-PCR验证参与胆固醇代谢的几种表达差异的基因,其中7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶表达明显下调,与基因芯片分析结果一致.结论:乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系存在基因表达差异,乙型肝炎病毒感染可能通过抑制参与胆固醇代谢的7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶从而进一步影响机体胆固醇代谢.     

23株HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因组分析

目的研究HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者HBV变异特点。方法PCR扩增并克隆HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV全基因组DNA,测序并进行基因结构分析。结果获得23株HBV全基因组DNA,它们均属于c或B基因型。与中国HBVB、C基因型参照序列相比,HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者来源的HBV在表面抗原、P蛋白、X蛋白的反式激活区及增强子II／核心启动子区发生了一些有意义的共有变异。结论HBV变异可能与HBeAg阳性慢性乙型肝炎的发生、发展有关。     

Inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by artificial microRNA

AIM： To investigate the inhibitory effects of hepatitis B virus （HBV） replication and expression by transfecting artificial microRNA （amiRNA） into HepG2.2.15 cells. METHODS： Three amiRNA-HBV plasmids were constructed and transfected into HepG2.2.15 cells. HBV antigen secretion was detected in the cells with transient and stable transfection by time-resolved fluoroimmunoassays （TRFIA）. HBV DNA replication was examined by ？ uorescence quantitative PCR, and the level of HBV S mRNA was measured by semi- quantitative RT-PCR. RESULTS： The efficiency of transient transfection of the vectors into 2.2.15 cells was 55%-60%. All the vectors had significant inhibition effects on HBsAg and HBeAg at 72 h and 96 h after transfection （P 〈 0.01 for all）. The secretion of HBsAg and HBeAg into the supernatant was inhibited by 49.8% ± 4.7% and 39.9% ± 6.7%, respectively, at 72 h in amiRNA- HBV-S608 plasmid transfection group. The copy of HBV DNA within culture supernatant was also significantly decreased at 72 h and 96 h after transfection （P 〈0.01 for all）. In the cells with stable transfection, the secretion of HBsAg and HBeAg into the supernatant was significantly inhibited in all three transfection groups （P 〈 0.01 for all, vs negative control）. The copies of HBV DNA were inhibited by 33.4% ± 3.0%, 60.8% ± 2.3% and 70.1% ± 3.3%, respectively. CONCLUSION： In HepG2.2.15 cells, HBV replication and expression could be inhibited by artif icial microRNA targeting the HBV S coding region. Vector-based artificial microRNA could be a promising therapeutic approach for chronic HBV infection.     

HBV蛋白诱导促炎症细胞因子白细胞介素32表达的研究

目的 研究HBV是否诱导白细胞介素32 (IL-32)表达及其机制.方法 用脂质体将HBV表达载体pIRES2-HBV-EGFP转染HepG2细胞,48 h后实时定量PCR、酶联免疫吸附法、Western blot分别在基因及蛋白质水平检测IL-32表达;核因子к β亚单位p50、p65蛋白分别与HepG2细胞共培养,48 h后在基因及蛋白质水平检测IL-32表达.HBV表达载体pIRES2-HBV-EGFP转染HepG2细胞,然后加入核因子к β抑制剂SN50,48h后Western blot检测IL-32表达水平.统计学分析采用SPSS16.0软件,用t检验比较组间差异.结果 转染HBV表达载体的细胞IL-32表达水平高于转染空载体的细胞,实时定量PCR检测示转染HBV表达载体组IL-32表达水平为空载体组的2.8倍,ELISA检测示转染HBV表达载体组IL-32表达水平为空载体组的4.2倍,两组之间的差异有统计学意义(P=0.002);核因子кβ亚单位p50、p65蛋白可诱导HepG2细胞表达IL-32(P=0.001);核因子к β抑制剂SN50抑制HBV表达载体诱导IL-32表达.结论 HBV诱导肝细胞表达IL-32,IL-32可能参与HBV感染引起的病毒性肝炎的发病机制.     

双位点核酶抑制细胞内乙型肝炎病毒表达的研究

目的 观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶在细胞内阻断Ｃ区基因表达的作用。方法 采用垩 克隆技术,从ｐＧＥＭ－核酶１２３（含针对ＨＢＶＣ区２０２９－２０３１及２０６３－２０６５双位点核酶）上切下双位点核酶的片段,定向克隆于真核表达载体ｐＢＢＳ２１２中,利用脂质体介导,将重组质粒ｐＢＢＳ２１２－Ｒｚ与Ｐ１,２Ⅱ（含乙型肝炎病毒全序列）花园要入人肝癌细胞（ＨＨＣＣ）中,采用原位杂交观察核酶的表达,ＥＬＩＡＳＡ     

乙型肝炎基因治疗的研究进展

基因治疗是指通过基因水平的操纵达到治疗或预防疾病的疗法,分体内疗法和体外疗法.前者是将外源基因直接导入人体发挥作用;     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因

目的 筛选与克隆HBeAg激活基因，了解其在体内的凋节功能线索。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3．1(-)-HBeAg转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为eDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染人肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到40个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～800bp插入片段。对插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得12种编码基因，包括11种已知基因和1种未知基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因，推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索，尚需进一步的实验证明。     

应用寡核苷酸芯片对乙型肝炎病毒转染HepG2细胞基因表达谱的研究

HBV与肝细胞之间相互作用的分子机制还不清楚，对HBV蛋白调控宿主细胞基因表达情况也了解甚少。本实验选用基因芯片进行HBV基因表达谱改变的研究，筛选HBV感染应答基因，探讨HBV感染的分子致病机制，寻找预防和治疗HBV感染的靶点。