戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的　建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法　将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果　建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论　利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。     

戊型肝炎病毒抗体双原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的 建立抗戊型肝炎病毒（HEV）抗体检测的双抗原夹心ELISA（DS-ELISA），并应用于多种动物血清的检测。方法 将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物醇（HRP）标记。利用5份阳性血清和40份阴性血清建立双抗原夹心ELISA；用400份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况；用3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂；用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛，绵羊，山羊，猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果 建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法，对400份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好，并且有更高的s/co比较；与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早，尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂；在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体，其中猪抗体的阳性率最高，表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论 利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA，并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。     

抗-HCVELISA间接法与双抗原夹心法试剂的应用对比评价

目的:对比研究国产抗-HCV ELISA间接法和双抗原夹心法试剂的检测效能,探讨血站抗-HCV检测模式。方法:选择1种双抗原夹心法酶联免疫试剂、2种间接法酶联免疫试剂分别检测34 593名无偿献血者血样,采用重组免疫印迹试验(RIBA)对其中有反应性的44份标本进行确认,并用BBI血清盘对这2种检测试剂进行考核评价。结果:科华、新创和万泰3个厂家的抗-HCV有反应性及灰区标本经RIBA实验确证后,假阳性率分别为31%、63%、13%。万泰双抗原夹心法与间接法相比,增加了反应强度、降低了假阳性率且缩短了窗口期。结论:为确保血液质量,血筛实验室应选择灵敏度和特异性双优的试剂,采用间接和双抗原夹心2种不同的ELISA试剂检测HCV抗体优于2种间接ELISA试剂,不仅提高抗-HCV有反应性标本的检出率,而且减少血液因假阳性造成的浪费。     

ELISA双抗原夹心法检测内脏利什曼病抗体的研究

目的观察rK39抗原酶联免疫吸附试验双抗原夹心法(ELISA夹心法)检测内脏利什曼病抗体用于内脏利什曼病诊断与宿主动物感染调查的可行性。方法采用ELISA夹心法与rK39免疫层析试条法(ICT)同步检测内脏利什曼病抗体。结果 5种家畜血清229份,7种鼠类标本238份,ELISA夹心法和rK39 ICT法抗体检测均阴性;接种利什曼原虫灰仓鼠、草原兔尾鼠标本33份,13份阳性,阳性率39.4%;塔里木兔标本119份,阳性7份,阳性率5.9%;非疫区儿童血清29份,全部阴性;疫区无内脏利什曼病症状人血清250份,4份两种方法均阳性,阳性率均为1.6%;住院内脏利什曼病病人血清67份,两种方法的阳性率分别为68.7%和67.2%。共检测人和其他动物标本965份,两种方法的阳性符合率98.6%,阴性符合率99.9%。ICT相同显色等级的阳性标本,ELISA跨10个滴度。结论 ELISA夹心法可检测多种动物内脏利什曼病抗体,抗体滴度具有定量意义。该方法适用于内脏利什曼病诊断、疗效观察和流行病学调查。     

胶体金免疫渗滤法快速诊断肾综合征出血热的临床研究

目的 建立一种快速，敏感的检测血清中抗汉坦病毒IgM抗体的方法。方法 将抗人IgM抗体点于硝酸纤维素膜上，以捕获患者血清中特异性IgM抗体，向已包被抗体的硝酸纤维素膜上滴加患者血清后，再选后滴加汉坦病毒抗原和鼠抗汉坦病毒抗体，最后滴加金标抗鼠抗体直接显色，阳性反应为红色，整个操作过程一般不超过10分钟。结果 用该法与IgM抗体捕获法ELISA对比检测51份肾综合征出血热（HFRS）患者血清标本，两法均阳性者49份，均阴性者2份。总符合率为100%，敏感性为96%。结论 胶体金免疫渗滤法操作简便，反应迅速，敏感性较高，适于在基层医疗单位中应用，可用于HFRS的早期诊断。     

抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定

目的将已筛选出的抗汉坦病毒核衣壳蛋白（NP）抗原单链抗体基因克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-scFv。方法提取含抗NP抗原单链抗体基因的T7噬菌体DNA,此为模板,PCR扩增单链抗体基因,BamHI和SalⅠ双酶切,经连接酶与BamHⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pGEX-6p-1连接;重组DNA转化入宿主菌E．coli BL-21（DE3）,琼脂糖凝胶电泳初筛选阳性重组质粒,并用PCR法、双酶切法及DNA测序鉴定。结果重组质粒pGEX-6P-1-scFv经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,片段大小分别为5000bp和750bp,与预期值一致;重组质粒PCR产物大小为750bp,与预期值一致;测定重组质粒序列,并与scFv序列比较,结果相一致。抗NP单链抗体基因序列克隆人表达载体pGEX-6p-1。结论成功构建了含抗汉坦病毒NP抗原单链抗体基因的重组原核表达质粒pGEX-6P-1-SCFv。     

双夹心DIGFA检测血吸虫循环抗原的应用研究

以日本血吸虫重组极低密度脂蛋白（ＳＶＬＢＰ）制备的多抗为捕捉抗体，胶体金标记血吸虫虫卵多克隆抗体为覆盖抗体，采用双夹心金标免疫渗滤法（ＤＩＧＦＡ）检测血吸虫病病人血清中循环抗原。结果７０份急性血吸虫病病人血清的阳性率为１００％，１５９份慢性血吸虫病病人血清的阳性检出率为６２．３％；１２０份流行区健康人群血清检测均阴性；１００份非流行区健康人群血清，２份呈阳性反应，假阳性率为２％。与肺吸虫病病人血清     

间接法和夹心法HCV抗体诊断试剂盒的诊断性能评价与选择

目的对国产双抗原夹心酶联免疫法和间接酶联免疫法丙型肝炎抗原检测试剂进行诊断性能评价与选择。方法选择1种夹心法和3种间接法国产检测试剂,同时对60份血清盘标本和40份血液筛查标本进行检测,血液筛查标本的检测结果为阳性或灰区,并经确认试验确认。试剂间比较采用配对卡方检验;对假阴性率进行R×C列联表检验。结果 3种间接法试剂和夹心法试剂的灵敏度分别为90.2%、78.0%、95.1%和97.6%;特异度分别为78.1%、72.6%、94.1%和100%。夹心法的分析灵敏度比间接法高4~8倍,不同试剂及试剂组合的R×C列联表检验结果:χ2=29.898,P0.05。结论夹心法试剂诊断特性优于间接法试剂,夹心法与间接法试剂搭配,可明显降低假阴性率,有效防止漏检。     

抗-HCV ELISA试剂评价体系的建立及检测结果

目的:建立丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断试剂评价参考系统,筛选出适合本地区的献血员抗-HCV检测策略。方法:使用Chiron的RIBA HCV 3.0试剂确认献血员中筛查出抗-HCV阳性和阴性的血清标本,建立抗-HCV参比血清,评价8种国内外抗-HCV EIA试剂的灵敏度、特异度、符合率等指标。结果:构建了抗-HCV诊断试剂评价质控体系,分别包括24份抗-HCV阳性标本、24份抗-HCV阴性标本及8份用于灵敏度评价的系列稀释标本;8种抗-HCV EIA试剂对参比血清的检测结果 Kappa值分别为0.67、0.71、0.75、0.75、0.88、0.79、0.58。结论:自制抗-HCV试剂评价体系更适合各地的试剂评价工作,在制定筛查策略时,双抗原夹心法试剂优于间接法试剂。     

酶联结增强化学发光法(ELECL)诊断血吸虫病的初步研究

本试验采用酶联结增强化学发光法(ELECL)检测日本血吸虫病患者血清中循环抗原,同时就其灵敏度与双抗体夹心ELISA法进行了比较。ELECL法检测血清中循环抗原发光峰值与病人血清稀释度成反比。血清稀释度为1:2560时的发光峰值略低于ELECL阳性判断标准的临界值。同一份标本测定三次,其变异系数为6.7～12.8％。用双抗体夹心ELISA法检测血清中循环抗原,病人血清稀释度为1:40时,其OD值接近ELISA阳性判断标准的临界值。结果表明,ELECL法的灵敏度远较ELISA法高。     

汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的通过建立汉坦病毒实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测汉坦病毒。方法根据汉滩型和汉城型汉坦病S片段基因的序列分别设计特异性探针引物,使用含有目的基因片段的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立检测两型汉坦病毒的实时荧光定量PCR方法。结果建立的检测方法特异性良好,与其他常见病原不发生交叉反应;最低检测限为101copies/μl,灵敏度高;不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系表达式分别为y=-3.4607x＋40.988（HTN）,y=-3.5307x＋39.356（SEO）,扩增效率分别为92.2%（HTN）和92.6%（SEO）,相关系数R2分别为0.9968（HTN）和0.9997（SEO）,呈良好的线性关系,且重复性好。结论建立的实时荧光定量PCR灵敏度高,重复性好,可用于汉坦病毒的快速检测,并可初步辨别汉滩型和汉城型汉坦病毒,对肾综合征出血热的病原早期诊断和流行病学调查有较好的应用价值。     

化学发光免疫分析检测丙肝病毒抗体在血液筛查中的应用评价

目的:评价化学发光免疫分析(CLIA)测定丙肝病毒(HCV)抗体的方法学性能在血液筛查中的应用。方法:以辣根过氧化物酶(HRP)为酶标记物,以鲁米诺为发光底物,采用双抗原夹心法检测血样中的抗-HCV。建立抗-HCV化学发光酶免疫分析方法,与常规使用的抗-HCV酶联免疫分析方法(ELISA)同时检测20例发光值(RLU)大于14 000的抗-HCV血清阳性标本,再用荧光定量RT-PCR检测;每天用卫生部临床检验中心指定生产的HCV的质控血清对CLIA进行检测,建立自己实验室的该项目临界值浓度,连续6个月对HCV质控血清检测,计算S/CO值,统计分析精密度、CV;用EQA的质控物检测HCV抗体,进行标本符合率计算。结果:CLIA方法的灵敏度为0.02ng/mL,阳性符合率为100%,ELISA的阳性符合率为75.2%,荧光定量RT-PCR检测的阳性符合率为100%。结论:HCV抗体CLIA检测抗-HCV试验方法的敏感性、准确性、稳定性较好,能满足临床输血早期筛查,以排除假阳性,杜绝漏检的风险。     

Development of EIA for detection of Chlamydia trachomatis in genital specimens

A double antibody sandwich enzyme immunoassay (EIA) for chlamydial antigen detection was developed using a monoclonal antibody against lipopolysaccharide (LPS) of Chlamydia trachomatis as a coating antibody. Polyclonal rabbit antiserum against partially purified antigen from elementary body (EB) antibody and horse-radish peroxidase conjugated goat anti-rabbit antibody were used as the primary and secondary antibody respectively. The developed EIA could detect protein of partially purified EB at the lowest concentration of 250 ng/ml. The assay was evaluated against the cell culture (CC), DNA hybridization assay (PACE2 system: Gen-Probe, San Diego, CA, USA) and a commercial enzyme immunoassay (kEIA) (Bioquest, NSW, Australia). The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the developed EIA (dEIA) were 87, 96.2, 80, 97.7 for the specimens from females and 90.9, 90.7, 71.4, 97.5 for the specimens from males repectively. Cross reaction was not found with Escherichia coli, Acinetobacter anitratus, beta-Streptococcus group A, Enterobacter spp, Enterococcus, Lactobacillus spp, Neisseria spp, but it was found with Candida albicans and herpes simplex virus type 1. The developed EIA can be applied successfully for both genders, particularly males. The cost per test is less than those for CC, kEIA and PACE2.     

旋毛虫病免疫学诊断研究进展

旋毛虫病（trichinellosis）是一种危害严重的人畜共患寄生虫病,人因食入生的或不熟的含活幼虫囊包的肉类及其制品而感染.肌肉活检是该病确诊的依据,但是受摘取组织局限性的影响,不易检出幼虫,容易漏诊.免疫学诊断技术常常作为检测重要的辅助手段.该文概述了酶联免疫吸附试验、凝集试验、免疫酶染色试验、间接荧光抗体技术、快速免疫层析法、斑点免疫金渗滤法酶联免疫电转移印记技术等7种旋毛虫病免疫学诊断的抗体检测方法和1种抗原检测方法,并对早期、快速、准确诊断旋毛虫病的检测方法进行分析评价.     

新城疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的初步建立

目的制备新城疫病毒(NDV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(单抗),并用于建立一种可定量检测NDV病毒含量的双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测方法(NDV NP ELISA)。方法基于NDV病毒株F48E9获得NP基因,经原核表达方式制备出重组抗原rNP;免疫小鼠制备NDV NP特异性单抗;单抗经HRP标记和配对筛选,建立NDV NP ELISA,分析其特异性、灵敏度、精密度、准确度和检测线性,并分析本方法定量检测的NP含量与PFU病毒滴度的定量相关性。结果建立基于单抗3C10和4E7的NDV NP ELISA,其定量检测NDV rNP的最佳线性范围为0.015~0.250μg/ml(R2=0.9974),回收率在88.4%~106.01%,变异系数小于3.4%;该方法具有良好特异性;该方法定量检测NDV抗原含量与PFU病毒感染滴度有较好的相关性(R2=0.9209)。结论建立NDV NP ELISA,可准确定量检测NDV病毒中的NP抗原含量,为NDV病毒含量的测定提供一种可靠简便的分析方法。     

2007年浙江丽水地区汉坦病毒的分离与型别鉴定

目的对2007年从浙江省丽水地区肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫区鼠肺分离的汉坦病毒进行型别鉴定和分子生物学特性研究。方法将汉坦病毒抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离汉坦病毒。提取病毒总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒S基因全片段,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析,应用DNA STAR软件分析比较,确定病毒型别。结果从疫区7份阳性鼠肺中分离到2株汉坦病毒,经汉坦病毒单克隆直接荧光血清检查和基因序列测定,结果为汉滩型(HTN)病毒,2株病毒与国际标准株76-118(HTN型)和80-39(SEO型)S片段核苷酸的同源性分别为84.7%、84.6%和64.2%、64.0%。结论浙江省丽水地区可能存在以HTN型病毒为主的肾综合征出血热自然疫源地。     

胶体金免疫层析法检测广州管圆线虫感染小鼠血清特异性抗体的研究

目的建立一种无需仪器、操作简单,具较好敏感性和特异性的适用于基层快速检测广州管网线虫感染的胶体金免疫层析方法。方法将重组广州管圆线虫五期幼虫抗原Acll蛋白为检测点膜抗原,羊抗兔IgG喷涂存质控线,与胶体金标记兔抗小鼠单抗组装成广州管圆线虫胶体金免疫层析法检测试剂条,用于检测阳性小鼠血清特异性抗体。试验设阴性小鼠血清为对照。结果确定试剂条的检测条件为：检测线重组抗原Acll用量为4mg／mI（喷量1μl／cm）,质控线羊抗兔IgG用量为1．87mg／ml（喷量1 μl／cm）,胶体金标记兔抗小鼠单抗采用吸光度（A）值为5的喷涂世（喷量2 μl／cm）。用该方法检测小鼠血清抗广州管线虫抗体,其敏感性为100％（10／10）,特异性为100％（10／10）。结论胶体金免疫层析法检测广州管圆线虫抗体具有较好的敏感性和特异性,经进一步完善后有望用于广州管网线虫病的临床快速筛查和流行病学调查。     

卵黄抗体IgY检测血吸虫病人循环抗原的初步研究

目的 探讨抗可溶性虫卵抗原（SEA）卵黄抗体（IgY）检测血吸虫循环抗原的应用价值。方法以纯化的鸡IgY作为捕捉抗体,以酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B为检测抗体的双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（S-ELISA）检测急、慢性血吸虫病人和健康人血清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验法（SEA-ELISA）作比较。结果S-ELISA测得SEA浓度（y）与吸光度（A450）值（x）呈明显的正相关（y=459．22x-108．14,r=0．9481）。急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100．00％（9／9）,慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84．44％（38／45）,健康人的特异性为96．00％（48／50）。两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论S-ELISA具有较好的敏感性和特异性,可用于血吸虫病免疫诊断。