抗血小板单克隆抗体重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:在原核细胞中表达抗血小板Fab抗体,为研制治疗性抗血小板抗体奠定基础.方法:从含有抗血小板抗体轻链基因和重链Fd段基因的克隆载体pGEM T-Easy上经双酶切获得抗体轻链基因和重链Fd段基因片段,将其以特定位点分别插入噬菌体抗体表达载体p3MH上,构建原核表达重组质粒p3MH/P140κ-Fd.转化E. coli XLI-Blu感受态细胞,并进行诱导表达,用ELISA方法进行鉴定.结果:血小板抗体轻链基因和重链Fd段基因片段准确插入p3MH载体,重组质粒在大肠杆菌表达的上清中含有与血小板特异性结合的Fab抗体.结论:在原核细胞中成功克隆并高效表达了可溶性的抗血小板Fab抗体.     

携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.     

重组E.coli L-天冬酰胺酶在大鼠中的药物代谢动力学

应用放射性核素示踪技术研究^125I重组E.coliL－天冬酰胺酶在大鼠体内的药物代谢动力学。^125I重组L－天冬氨酶静脉注射后24h内，在尿、粪、胆汁中的排泄量分别占注射剂量的68．95％，4．44％和5．36％。测定血浆中^125I重组E.coliL－天冬酰胺酶浓度，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物成像分析系统结合方法评价原药水平，由房室模型评价药物动力学参数，静注后，浓度时间曲线符合二房室模型，初期和末端的t1/2分别为0．52－0．63h和2．39－2．76h，AUFC与剂量成正比。重组E.coliL－天冬酰胺酶的分解代谢产物主要随尿液排泄，重组E.coliL－天冬酰胺酶在大鼠中的药物热力学参数为临床试验提供了有用依据。     

头孢曲松钠治疗大肠杆菌所致疾病机制的研究

目的探讨头孢曲松钠对大肠杆菌(E.coliK1)的作用机制。方法采用对照实验,培养E.coliK1至最佳状态,实验组细菌加入头孢曲松钠100μg,对照组加入生理盐水,孵育1h。通过western-blot方法检测E.coliK1外膜蛋白A的表达变化,软件分析蛋白表达灰度值。结果实验组OmpA与对照组比较,表达量明显下降。结论头孢曲松钠可以诱导E.coliK1的外膜蛋白A表达下降,从而影响E.coliK1外膜的完整性。     

血必净联合亚胺培南西司他丁钠治疗大肠埃希菌肺炎患者的效果观察

目的 观察血必净联合亚胺培南西司他丁钠治疗大肠埃希菌肺炎患者的效果.方法 采用前瞻性研究方法,选择2014年3至2016年3月入院并且诊断为大肠埃希菌肺炎的患者68例作为研究对象,将其随机分为观察组(n=34)和对照组(n=34).于治疗前后检测体温、白细胞总数、降钙素原、痰培养、胸CT及CPIS,将其作为观察指标.对照组采用传统西医疗法,予亚胺培南西司他丁钠抗菌治疗;观察组采用中西医结合疗法,予血必净、亚胺培南西司他丁钠联合抗菌治疗;均连续治疗7d.比较每组治疗第7天相关指标,并在患者出院时记录住院天数.结果 与治疗前相比,两组治疗后体温(T)、白细胞总数(WBC)、降钙素原(PCT)、CPIS均显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.01);治疗后,观察组T、WBC、PCT、CPIS均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05);与对照组相比,观察组经治疗后临床有效率较高,住院天数下降,差异有统计学意义(P＜ 0.05).结论 血必净联合亚胺培南西司他丁钠能有效抑制大肠埃希菌感染引起的炎性反应,减轻患者临床症状,减少住院天数.     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

人粒细胞集落刺激因子基因重组及在E.coli中的表达和鉴定

将RT－PCR扩增的人粒细胞集落刺激因子（hG－CSF）结构基因与表达载体pJGW1重组，转化含有pGP1－2质粒的E.coliDH5α，进行温度诱导表达。经SDS－PAGE分析，rhG－CSF表达量占菌体总蛋白量的30％以上。将其复性，经CM－52FF离子交换层析纯化，纯化后的rhG－CSF（纯度＞98％）经SDS－PAGE测定分子量约为19kD；经胰酶裂解、反相HPLC分析肽谱具有8条特异肽段；等电聚焦测定PI值约为5．8；免疫印迹实验证实其与标准hG－CSF具有相同的抗原反应特异性；NH2-末端氨基酸分析与文献报道一致，采用小鼠白血病细胞株NFS－60测定活性为I×108IU／mg。     

人过氧化氢酶基因的克隆与表达

目的利用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达人过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从人cDNA文库中获得CAT编码基因,并利用pMAL-c2x、pBV221质粒分别构建了融合和非融合表达载体并进行了表达和活性检测。结果融合表达与非融合表达均可获得可溶性蛋白质,非融合的表达产物具有CAT活性,而融合表达产物在切除融合蛋白质(MBP)部分后表现出明显的CAT活性。结论从大肠杆菌表达体系能表达具有生物活性的CAT,此项研究为后续重组酶性质的研究和开发利用奠定了基础。     

克林沙星与5种抗生素对鸡致病性大肠埃希菌体外联合抗菌效果

目的 探讨克林沙星与5种抗生素对鸡致病性大肠埃希菌体外联合抗菌效果.方法 采用微量稀释法和棋盘法,测定了克林沙星和甲氧苄啶(TMP)分别与磷霉素钠、头孢拉定、哌拉西林、痢菌净和多黏菌素5种抗菌药物的联合用药对鸡致病性大肠埃希菌和标准质控菌(ATCC25922)的最小抑菌浓度(MIC)及分级抑菌浓度(FIC)指数.结果 分别得到7种抗生素对鸡致病性大肠埃希菌的MIC值,显示均有抗菌效能;在鸡致病性大肠埃希菌的体外抗菌效果中,克林沙星与磷霉素钠、多黏菌素和痢菌净联合用药表现为协同作用,与哌拉西林为相加作用,与头孢拉定为无关作用;TMP与多黏菌素和痢菌净为协同作用,与磷霉素钠和头孢拉定为相加作用,与哌拉西林为无关作用.结论该体外研究为临床合理应用克林沙星提供了试验依据.     

蛇毒蛋白基因的大肠杆菌表达研究进展

蛇毒是多种生物活性蛋白和多肽的混合物，由于蛇毒在基础医学和临床上的特殊作用以及天然蛇毒蛋白获取方法的局限性，采用生物工程方法规模化生产高纯度的蛇毒蛋白已成为当前及今后的研究方向。该文就蛇毒蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究近况进行介绍。     

内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coliJM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率最高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。     

应用ELISA法检测门冬酰胺酶中残余大肠杆菌菌体蛋白含量的研究

采用Cygnus公司"大肠杆菌菌体残留蛋白检测试剂盒"检测门冬酰胺酶中残余宿主菌菌体蛋白含量,建立门冬酰胺酶中宿主菌菌体蛋白残留检测方法并进行了相关方法验证。验证结果表明:宿主菌菌体蛋白浓度在0～100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.99,不同实验人员测得的精密度RSD均小于5%,平均回收率为94.34%。通过对8批门冬酰胺酶样品的检测,测得门冬酰胺酶中的残余宿主菌体蛋白含量均小于550×10-6。该方法具有快速,操作安全简便等优点,灵敏度高,重现性好,可用于门冬酰胺酶的宿主菌体蛋白的残留检测。