带有引导序列的抗-D抗体可变区基因的扩增和序列分析

目的:从引导区扩增获得高度特异性和亲和力的抗-D抗体的可变区基因, 并进行序列分析。方法:提取1株分泌抗-D抗体的人B淋巴细胞株的总RNA, 从引导区设计引物, RT-PCR扩增抗-D抗体的可变区基因, 分别对扩增产物进行分子克隆和测序。结果:用重链引物和轻链引物分别扩增出440bp和410bp的特异带。序列分析表明, 其核苷酸及其所推导的氨基酸(AA)序列符合人Ig可变区基因的序列特征。结论:获得了抗-D抗体可变区基因, 为基因工程抗-D的研制及Rh新生儿溶血病的预防提供物质基础。     

抗人CD3单链抗体基因的构建及序列分析

本文在已克隆抗人ＣＤ３抗体ＶＨ和ＶＫ基因的基础上，设计并合成了ＰＣＲ引物。两个外侧引物分别含有ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ酶切位点及起始码和终止码序列，４个内侧引物各含部分连肽基因序列，回收后混合退火。     

小鼠抗—HBs的单克隆抗独特型抗体杂交瘤细胞系的建立及鉴定

用纯化的小鼠单克隆抗-HBs(Ab1)免疫同系BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓细胞融合,获得两株(MA1、MA3)持续分泌抗-HBs的单克隆抗独特型抗体(抗-1d,Ab2)杂交瘤细胞系。对MA3做了较全面的鉴定。MA3的Ig类型为IgM,核型分析结果染色体数为106条。通过ELISA竞争抑制和中和抑制试验表明,MA3所分泌的Ab2既能被不同来源的抗-HBs所中和,又能被HBsAg所竞争,且都呈现剂量依赖关系。将纯化的MA3 IgM免疫同系小鼠,诱导出具有抗-HBs活性的抗-抗-独特型抗体(Ab3)。因此认为MA3所分泌单克隆抗体(McAb),可模似HBsAg,具有类似HBsAg的免疫原性,是一种带有HBsAg表位内影像的抗-HBs的单克隆抗-1d。     

一株人源性抗HBsAg抗体Fab片段的筛选及序列分析

一株人源性抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段的筛选及序列分析高辉高磊纪宗玲路凡陈南春陈苏民余宙耀张宜俊尤玉琴粟宽源（第四军医大学生物化学教研室，西安７１００３１空军广州医院全军肝病中心）乙型肝炎是我国常见的传染性疾病，目前尚无特效的治疗手段。研究发...     

抗登革3型病毒单链抗体的可溶性表达和鉴定

目的为解决鼠源性单克隆抗体用於临床会引起变态反应等负作用问题，试图从基因水平上对登革３型病毒鼠源性单抗进行人源化改造以减少其鼠源性。方法选用对登革病毒４个血清型及部分黄病毒具有中和活性的抗登革３型病毒单克隆抗体３Ｄ３的轻重链可变区基因，通过反转录和聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩，扩增后的轻重链可变区ＰＣＲ产物通过连接引物连接成单链抗体基因，然后与噬菌体载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ连接，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，使单链抗体以可溶性的形式表达在上清液中。结果通过免疫荧光和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，可溶性表达的单链抗体能与登革３型病毒抗原发生特异性结合，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中在２８ｋＤ处有一条带和单链抗体的分子量大小一致。结论表达产物与原单抗３Ｄ３一样，具有与登革３型病毒抗原结合的特性。     

带有HBsAg表位内影像的单克隆抗独特型抗体的建立和鉴定

本文采用鼠单克隆抗-HBs(Ab_1)作抗原免疫同系鼠,取免疫鼠的脾细胞与SP_2/0骨髓瘤细胞融合,经过反复筛选、克隆化获得两株(B_3,C_2)持续分泌单克隆的抗独特型抗体其(Ab_2)。对其中之一B_3作了深入鉴定。B_3的Ig类型为IgG,亚类为IgG_2a。核型分析结果染色体数为106条。通过ELISA抑制试验对B_3进行鉴定,发现B_3一方面能与纯化HBsAg发生阳性的竞争性抑制,另一方面又能与不同来源的抗-HBs发生结合,出现阳性的中和抑制。无论竞争性抑制还是中和抑制,都呈现剂量依赖关系。将B_3Ig免疫同系鼠,经一次免疫后就能诱导出具有抗-HBs活性的抗-抗-独特型抗体(Ab_3)。以上结果表明:B_3株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗独特型抗体是带有HBsAg表位内影像的单克隆抗体。并对B_3Ig的可能应用意义进行了讨论。     

抗乙型肝炎病毒Pre S2 3B9单克隆抗体轻链可变区基因的扩增及序列分析

为了构建基因工程抗体并从分子水平分析抗乙型肝炎病毒ＰｒｅＳ２３Ｂ９单克隆抗体，我们利用分子生物学技术快速分离３Ｂ９杂交瘤细胞总ＲＮＡ，经反转录，ＰＣＲ扩增，分离获得了３Ｂ９单抗轻链可变区基因，并用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术及双脱氧核苷酸链末端终止法对该可变区基因的全部３２７ｂｐ核苷酸序列进行了测定。结果表明，３Ｂ９单抗轻链隶属小鼠免疫球蛋白Ｋａｐｐａ轻链第Ⅱ亚组，ＪＫ１微基因重排。     

单克隆抗人B型红细胞抗体NAN123

NAN 123单克隆抗体能凝集人B型红细胞,凝集反应能被2 ~(-6)M的蜜二糖或 2 ~(-2)M的半和糖完全阻断。类似的结果在以CNE_2细胞为靶抗原的ELISA反应中也可观察到。实验提示,NAN123抗体对B血型抗原末端的α-D-半乳糖有选择性识别能力。     

乙型肝炎病毒单克隆表面抗体的抗独特型抗体的制备与免疫效果

用乙型肝炎病毒单克隆表面抗体免疫新西兰兔制备抗独特型抗体，经小鼠γ球蛋白－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ免疫亲和柱纯化后，用ＥＬＩＳＡ鉴定，结果表明特异性良好。以此抗独特型抗体免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，引起抗－ＨＢ＿ｓ应答，提示制备抗独特型疫苗的可能性。     

腮腺炎病毒疫苗株与野毒株的部分核苷酸序列分析

目的比较腮腺炎病毒疫苗株与野毒株的核苷酸序列差异。方法腮腺炎病毒疫苗株Ｓ７９株和ＪｅｒｙｌＬｙｎｎ株在鸡胚细胞上从第５代连续传至第２５代,采用逆转录－套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）法,从传代前后的腮腺炎病毒疫苗株以及野毒株的基因组中扩增血凝素－神经氨酸酶基因片段（ＨＮ）、融合蛋白基因片段（Ｆ）和小分子疏水蛋白基因（ＳＨ）,并利用双脱氧核苷酸链终止法对ＰＣＲ产物进行测序。结果传代之前第５代的两种疫苗株的目的基因的核苷酸序列完全一致;传至第２５代的Ｓ７９株的目的基因的核苷酸序列比２５代的ＪｅｒｙｌＬｙｎｎ株显示了更高的突变率。比较现行疫苗株与野毒株的核苷酸序列后发现,１９９５年分离的野毒株的核苷酸序列与疫苗株有明显的差异。结论推测Ｓ７９株可能与ＪｅｒｙｌＬｙｎｎ株同源,同一地区可能有两种以上的腮腺炎病毒野毒株导致流行性腮腺炎的发生     

人细胞角蛋白19片段单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备人细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)的单克隆抗体(mAb),并对其免疫特性进行鉴定。方法用重组CYFRA21-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取血清效价最高小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出阳性杂交瘤细胞株,进行亚克隆,并鉴定分泌抗体亚型;制备小鼠腹水,用protein G从腹水中纯化出CYFRA21-1的mAb;用间接ELISA测定mAb的效价,Western blot和竞争ELISA对mAb的免疫特性进行检测,竞争ELISA对mAb的临床应用性进行评价。结果获得2G8和12G7两株能稳定分泌人CYFRA21-1mAb的杂交瘤细胞株,其分泌抗体都为轻链为κ的IgG1;两株mAb都能特异识别人血清中的CYFRA21-1,效价分别为1×10-6和5×10-7;检测134份血清样本CYFRA21-1含量的结果与北京源德生物医学工程有限公司CYFRA21-1化学发光法定量检测试剂盒检测结果的相关性分别为y=0.8167x+0.3755(r=0.9772)和y=0.8142x+0.3655(r=0.9770)。结论成功制备两株人CYFRA21-1的特异mAb,为后期人血清CYFRA21-1定量测定试剂盒的完全国产化奠定了良好的基础。     

汉滩病毒Z10株G1糖蛋白编码区克隆及序列分析

目的 汉滩病毒浙１０（Ｚ１０）株Ｇ１糖蛋白编码区的克隆、核苷酸序列分析，提供我国应用最为广泛的肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）疫苗株序列资料。方法 反转录ＰＣＲ法扩增Ｇ１基因片段，克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，双脱氧链终止法测定核苷酸序列。结果 测定１４４９个核苷酸，可编码４８３个氨基酸。与Ｉ型７６／１１８、Ｌｅｅ、Ｈｏｊｏ株比较核苷酸同源性分别为８７％、８６％、８６％，与Ⅱ型Ｒ２２株同源性为６７％。比较氨基     

贵州地区不同人群TTV核酸检测及部分核苷酸序列分析

目的 了解贵州地区TTV感染状况，分析TTV贵州株的基因特点。方法 以公布的TTV第1读码区序列设计两对寡核苷酸引物，用套式聚合酶链反应法(nested—PCR)检测贵州地区不同人群血清中TTV核酸(TTV DNA)，并对3份TTV DNA阳性血清的PcR产物，用直接测序法测定核苷酸序列。结果 62例正常人，37例志愿献血员，50例血液透析患者，107例静脉药瘾者及139例肝病患者血清中TTV DNA阳性率分别为6．45％(4／62)，8．1％(3／37)，26.0％(13／50)，25.23％(27／107)和16.55％(23／139)。在肝病组中，重型肝炎、肝硬化、肝癌患者的TTV DNA阳性率分别为35.71％(5／14)，14．15％(15／106)和15．79(3／19)。测定的282个核苷酸中，3株贵州株的同源性均高于99％，与日本株N22相比，同源性都为98％。结论 贵州存在TTV感染，血透患者中有较高的TTV感染率，TTV可能是重型肝炎的病原因子，3株贵州株可能为同一基因型。     

南京市部分幼儿TT病毒DNA检测及基因序列分析

目的 了解幼儿人群中TT病毒的流行率及基因判别。方法 设计、合成引物,采用半套式聚合酶链反应（hemi-nested PCR)方法检测幼儿血清标本并进行序列分析。结果 在110份幼儿血清中,TTV DNA总检出率为12．73％。在107名ALT正常,抗HAV－IgM、HBsAg、抗HCV阴性的幼儿血清中,TTV DNA检出率为11．2％（12／107）;从1名ALT升高幼儿血清中检出TTV DNA,从2名HBsSg阳性幼儿血清中检出TTV DNA阳性血清1份。对2株TTV DNA阳性株序列分析结果显示,它们与日本分离株N22、TA278（G1a)、TX011（G1b)、TS003(G2a)、NA004（G2b)和中国株CHN1相应位置核苷酸序列的同源性分别为83．3％／86．0％、84．2％／87．8％、93．7％／98．6％、67．6％／67．1％、64．9％／64．4％、83．8％／88．3％,经系统发育分析它们属于G1b型。结论 幼儿人群中存在TTV感染,TTV流行率为12．73％。TTV感染可能存在血源传播途径外的其他传播途径,并存在健康携带状态。     

不同肺腺癌细胞系N－ras、p53基因突变核酸测序分析

应用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＰＣＲ）和ｄｓＤＮＡｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｙｓｔｅｍ技术对体外培养的人肺腺癌细胞系ＬＴＥｐ－ａ＿２和ｈＬＡ中Ｎ－ｒａｓ癌基因及ｐ５３抑癌基因外显子５、７进行核酸序列测定分析。结果表明Ｎ－ｒａｓ突变热点第１２、１３、６１密码子未见异常。ｐ５３抑癌基因第１５４密码子均发现ＧＧＣ→ＧＴＣ突变（Ｇｌｙ→Ｖａｌ变异）。经光盘检索（美国Ｓｉｌｖｅｒｐｌａｔｔｅｒ公司提供的ＣＯ－ＲＯＭＭＥＤＩＬＩＮＥ）分析了１９８８～１９９３年间的专题文献，尚未见肺癌ｐ５３基因第１５４密码子突变的报道。     

两种分泌抗PrP单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其初步鉴定

目的 制备具有广谱种属反应性的PrP单克隆抗体(McAb)，用于可传播性海绵样脑病(TSE)的诊断及致病机制研究。方法 分别将对应于牛PrP29-48(BoP1)、PrP89-108(BoP2)的两种多肽与匙孔碱血蓝蛋白(KLH)偶联，免疫BALB／c小鼠，经细胞融合后获得分泌针对上述两种多肽的杂交瘤细胞株，用Western-blot方法检测这些细胞株分泌的McAb与牛(Bo)、人(Hu)和仓鼠(Ha)PrP蛋白的反应性。结果 通过细胞融合和2-3轮克隆化，用ELISA筛选出分泌抗BoPl和BoP2抗体的杂交瘤细胞株D11和D8。Western blot显示，获得的McAb均能分别与重组BoPrP(25-242)、重组HuPrP(23-231)和HaPrP(23-231)反应。结论 获得了可与牛、人和仓鼠PrP反应的两种McAb，可用于哺乳类PrP检测及TSE致病机制研究。     

庚型肝炎病毒NS5区基因序列测定和分析

目的为了研究哈尔滨市庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）非结构（ＮＳ５）区基因结构特征。方法对阳性标本进行了庚型肝炎病毒ＮＳ５区１８６核苷酸的基因扩增、分子克隆和序列分析，并利用基因分析软件处理结果。结果分离出的２株ＨＧＶＮＳ５区基因序列之间同源性为９５２％，而与国外报道的３株ＨＧＶ序列比较同源性在８４４％～９２４％，变异较大。结论提示ＨＧＶ有不同的基因型，这有待于对各区基因序列进行全面检测，综合判断之后才能确定。分离出的阳性株为从１９８４年肝炎患者血中分离，肯定了我市在８０年代就有庚型肝炎病毒感染存在     

抗登革病毒3型单链抗体的基因克隆表达和免疫学鉴定

目的研究单链抗体在治疗中的免疫反应问题。方法选用对登革病毒四个血清型及部分黄病毒具有中和活性的抗登革３型病毒单克隆抗体３Ｄ３的轻重链可变区基因，通过反转录和聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，扩增后的轻重链可变区ＰＣＲ产物通过一个９３个核苷酸连接引物连接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ），然后将其基因克隆到噬菌体表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５的外壳蛋白ｇ３ｐ基因中，使单链抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面。结果通过免疫荧光鉴定，这种抗体仍保留着亲代抗体的特性，能与登革３型病毒发生特异性结合。结论这一研究结果为登革３型病毒抗体在登革病毒的诊断和治疗的应用奠定了基础。