神经生长因子对N-甲基-D-门冬氨酸诱导人胚胎RPE细胞凋亡的保护作用

目的 探讨神经生长因子(NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮(hFRPE)细胞凋亡的保护作用。方法 将传代培养的hFRPE细胞,用200μmol/L,300μmol/L N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)建立诱导的hFRPE细胞凋亡模型,并用吖啶橙(AO)荧光染色计数和透射电镜(TEM)观察NGF对凋亡细胞的保护作用。 结果 用AO荧光染色及TEM均观察到经200 μmol/L,300μmol/L NMDA处理72 h后的hFRPE细胞出现典型的凋亡形态学改变。200μmol/L.NMDA作用72 h后hFRPE细胞凋亡指数为(32.587 9±1.488 0)％和200 μmol/L NMDA+300 μmg/L NGF作用72 h后的hFRPE细胞凋亡指数(20.768 7±1.302 4)％相比,差异有显著性(q=2.941 4,P=0.005 0);300 μmol/L NMDA作用72 h后hFRPE细胞凋亡指数为(42.506 4±3.014 8)％,与300 μmol/L NMDA+300 μg/L NGF作用72 h后的hFRPE细胞凋亡指数(25.687 2±1.8974)％相比,差异有非常显著性的意义(q=4.117 8,P=0.000 0)。 结论 NCF能拈抗NMDA诱导的hFRPE细胞凋亡。     

神经生长因子对过氧化氢诱导人胚胎视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

目的　探讨神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (human fetal retinal pigm ent epithelium,h FRPE)细胞凋亡的保护作用。方法用传代培养的 h FRPE细胞 ,30 0、5 0 0 μmol· L- 1 过氧化氢 (hydrogen peroxide,H2 O2 )建立诱导的 h FRPE细胞凋亡模型 ,并用吖啶橙 (acridine orange,AO)荧光染色计数和透射电镜 (transmission electron microscope,TEM)观察 NGF对凋亡细胞的保护作用。结果　用AO荧光染色及 TEM均观察到经 30 0、5 0 0μmol· L- 1 H2 O2 处理 6 5 h后的 h FRPE细胞出现典型的凋亡形态学改变。 30 0μm ol· L- 1 H2 O2 作用 6 5 h后 h FRPE细胞凋亡指数为4 5 .6 2 %± 1.4 1%和 30 0μmol· L- 1 H2 O2 +40 0μg· L- 1 NGF作用 6 5 h后的 h FRPE细胞凋亡指数 2 2 .79%± 1.30 %相比 ,差异有显著性 (q=4 .84 4 5 ,P=0 .0 0 0 0 ) ;5 0 0μmol· L- 1H2 O2 作用 6 5 h后 h FRPE细胞凋亡指数为 6 6 .2 2 %± 1.86 %和 5 0 0 μm ol· L- 1 H2 O2 +40 0 μg· L- 1 NGF作用 6 5 h后的 h FRPE细胞凋亡指数 4 2 .5 6 %± 1.2 1%相比差异有非常显著性的意义 (q=5 .114 2 ,P=0 .0 0 0 0 )。结论　 NGF能拮抗 H2 O2 诱导的 h FRPE细胞凋亡     

全反式视黄酸对诱导为神经元样细胞的脐带间充质干细胞分化和凋亡的影响

目的 观察不同浓度全反式视黄酸(ATRA)在诱导脐带间充质干细胞(MSC)向神经元样细胞分化中对细胞形态、增殖、凋亡的作用并筛选其最适诱导浓度.方法 实验研究.取生长良好的第3代脐带MSC接种于24孔培养板,细胞贴壁后培养基更换为含ATRA的DMEM/F-12培养液.ATHA终浓度分别为0 μmol/L(对照组,A组)、0.25 μmol/L(B组)、0.5 μmol/L(C组)、1.0 μmol/L(D组)、2.0 μmol/L(E组)、4.0 μmoL/L(F组),诱导后1 h、24 h观察细胞形态,并应用MTT法监测ATBA的细胞毒性.另取对照组和经各浓度ATRA诱导24 h后的细胞应用Annexin-V/PI联合流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率和双标染色后的细胞着色情况,综合上述指标确定ATRA诱导脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的最适浓度.根据资料性质,对不同浓度ATRA作用24 h后各组间A值、细胞凋亡率进行比较,采用单因素方差分析,并应用t检验进一步进行两两比较;对照组和ATRA诱导组之间神经元样细胞阳性表达率的比较采用配对资料的t检验.结果 与对照组相比,ATRA(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L)对MSC形态、细胞增殖、细胞凋亡均无明显影响(t=0.72,1.32;P>0.05);高浓度(4.0 μmoL/L)加入后即刻可见部分细胞浮起,24 h后无贴壁细胞;≥1.0 μmol/LATRA诱导24 h后能极显著抑制细胞增殖(t=8.8,18.9,22.1;P<0.01),且随ATRA浓度增加,抑制作用越明显.诱导24 h后,2.0 μmol/L组细胞回缩较1 h更明显,大部分细胞由长梭形回缩至类圆形,细胞质内出现粗大颗粒,部分细胞漂浮;1.0 μmoL/L组中仅有少数细胞有形态改变;Annexin-V/PI联合FCM检测显示≥1.0 μmol/L组细胞凋亡率与对照组间差异有统计学意义(t=9.88,19.95,31.6l;P<0.01).结论 0.5 μmol/L ATRA是诱导脐带MSC向神经元样细胞转化的最佳剂量,≥1.0 μmol/L能明显抑制MSC的增殖,增加细胞凋亡率并诱导细胞发生明显损伤.     

吲哚美辛对体外培养的RPE细胞增殖及DNA合成的影响

目的探讨吲哚美辛(IN)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞的抑制作用及DNA合成的影响。方法 分别用核酸蛋白分析仪测定加入50、100、200、400、600μmol/L IN作用24 h后RPE细胞DNA质量浓度的变化和MTT法测定加入100、200、400、600、800、1 000 μmol/L IN 12 h后RPE细胞数量的改变。 结果 前者其细胞DNA质量浓度(单位:μg/ml)分别为101.171 2±15.512 4、88.640 0±13.584 5、72.365 1±7.796 9、5.908 9±10.722 9、51.223 6±8.775 7。与对照组21 3.735 1±83.157 2相比,差异有显著性(q值分别为5.481、6.091、6.883、7.490、7.912,P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000);后者其细胞A值分别为0.236 7±0.054 6、0.168 7±0.069 5、0.081 9±0.034 6、0.065 6±0.017 6、0.055 4±0.028 6、0.050 8±0.027 7。与对照组0.267 4 ±0.043 0相比,差异有显著性(q值分别为1.442、4.621、8.682、9.447、9.925、10.140,P值分别为0.158、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)。 结论 IN可抑制体外培养的RPE细胞的DNA合成及增殖。     

三氧化二砷诱导人晶状体上皮细胞凋亡的机制研究

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对离体培养的人晶状体上皮细胞(FHL124)的凋亡及其作用机制.方法 实验研究.四甲基偶氮唑盐比色法观察As2O3对FHL124细胞的抑制作用;原位缺口末端标记(TUNEL)法测定细胞凋亡;Taqman实时荧光定量PCR检测基因表达的变化;荧光显微镜动态监测细胞内Ca2+浓度的变化.As2O3对FHL124细胞的生长抑制和细胞内Ca2+浓度的变化采用t检验进行分析;3种基因不同处理组间表达水平差异的比较采用Wilks'λ检验;单个基因比较采用LSD-t检验.结果 As2O3(3×10-7～1×10-4mol/L)对FHL124细胞的作用呈浓度依赖性,1 μmol/L As2O3即可显著抑制FHL124细胞的生长,半效抑制量(IC50)为1.5 μmol/L.TUNEL检测证实As2O3诱导FHL124细胞凋亡,引起FHL12A细胞DNA断裂.实时定量荧光PCR结果显示,As2O3可以引起FHL124细胞与内质网应激信号传导有关的基因产物EIF2A,ERN1和ATF6显著增加(F=8.51,P=0.0005).细胞内Ca2+测定显示As2O3降低细胞内Ca2+浓度,从而降低了Ca2+信号的峰值.20 μmol/L As2O3孵育30 min后,峰值降低了(66.34±4.47)%(P=0.0018),60 min则降低了(96.95±7.98)%(P=0.0002).20 μmol/L As2O3使Ca2+内流幅值及速度分别降低了(22.59±2.98)%和(39.69±6.01)%.结论 As2O3抑制FHL124细胞的生长并诱导细胞凋亡,诱导内质网应激可能是其重要作用机制之一.     

N-乙酰半胱氨酸及salubrinal对全反式视黄酸诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的抑制作用

目的观察抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及选择性内质网应激反应抑制剂salubrinal在全反式视黄酸(ATRA)诱导视网膜色素上皮细胞(RPE)凋亡中的作用。方法取ARPE-19细胞系进行培养, 并将其分为正常对照组、模型对照组、NAC处理组、salubrinal处理组、NAC+salubrinal组, 分别采用完全培养基、含10 μmol/L ATRA、含10 μmol/L ATRA+5 mmol/L NAC、含10 μmol/L ATRA+40 μmol/L salubrinal、含10 μmol/L ATRA+5 mmol/L NAC+40 μmol/L salubrinal的完全培养基培养细胞24 h。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡比率、多重含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Multicaspase)阳性比率、活性氧簇(ROS)水平。Western blot法检测各组细胞血管内皮生长因子A(VEGF-A)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、剪切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase 3)的表达水平。结果流式细胞检测结果显示, 各处理组细胞凋亡比率、Mu...     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

雷帕霉素对缺氧损伤视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

背景 研究表明雷帕霉素(Rapa)可延缓人大脑细胞的衰老,改善大鼠局灶性脑缺血时脑组织代谢活动,对中枢神经细胞具有保护作用.视神经和视网膜神经节细胞(RGCs)属于中枢神经组织,但Rapa是否可对外伤后RGCs具有保护作用尚不清楚. 目的 探讨Rapa对氯化钴(CoCl2)诱导的缺氧损伤大鼠RGCs的保护作用,并探讨其可能的作用机制,为外伤性视神经病变(TON)的治疗提供新的思路.方法 用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养大鼠RGC-5细胞,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化.将细胞分为正常对照组及50、100、200、400和600 μmol/L CoCl2组,于细胞培养后24 h和48 h采用细胞生长分析系统检测各组细胞存活率.采用200 μmol/L CoCl2处理细胞以诱导建立RGC-5细胞缺氧损伤模型,然后将培养的细胞分为正常对照组、模型对照组和不同浓度Rapa干预组,Rapa干预组在缺氧模型细胞培养液中添加Rapa使其终浓度分别为0.1、0.4、1.6和6.4μmol/L,处理细胞24 h.采用细胞生长分析系统检测各组细胞的存活率;采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率;采用JC-1染色技术检测各组细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞促凋亡基因bax mRNA的相对表达量. 结果 200 μmol/L CoC12作用RGC-5细胞后24 h细胞相对存活率为(70.51±5.00)％,与正常对照组的(100.00±3.29)％比较,差异有统计学意义(P＜0.01),成功构建细胞缺氧损伤模型.正常对照组、模型对照组和0.1、0.4、1.6、6.4 μmol/L Rapa干预组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义(F=167.904,P=0.000),其中0.1μmol/L Rapa干预组细胞存活率明显高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).正常对照组、模型对照组和0.1μmol/L Rapa干预组细胞凋亡率分别为25.4％、37.7％和25.3％,细胞线粒体膜电位分别下降了0.4％、6.3％和1.4％.正常对照组、模型对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组细胞中baxmRNA相对表达量分别为1.01±0.21、3.52±0.30和1.66±0.20,总体比较差异有统计学意义(F=88.034,P=0.000),其中模型对照组细胞中bax mRNA相对表达量均明显高于正常对照组和0.1μmol/L Rapa干预组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 Rapa可对CoC12诱导的缺氧RGC-5细胞发挥保护作用,其主要作用机制是下调细胞中促凋亡分子bax的表达,并提高RGC-5细胞存活率.     

神经生长因子对人胚胎视网膜色素上皮细胞生长及其DNA合成的影响

目的　探讨神经生长因子 (NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (RPE)细胞的促增殖作用及DNA合成的影响。方法　分别用MTT法测定加入NGF 10 0、2 0 0、30 0 μg/L 48h后人RPE细胞数量的改变和核酸蛋白分析仪测定加入NGF 5 0、10 0、2 0 0、30 0、40 0 μg/L 48h后人RPE细胞DNA质量浓度的变化。 结果　 10 0、2 0 0、30 0 μg/LNGF作用 48h后其细胞增殖的A值分别为 ( 0 2 137± 0 0 2 33)、( 0 2 188± 0 0 181)、( 0 2 32 2± 0 0 16 4) ,与对照组 ( 0 1897± 0 0 15 2 )相比 ,差异有显著性 (q test ,P <0 0 5 ) ;10 0、2 0 0、30 0、40 0 μg/LNGF作用 48h后其细胞DNA质量浓度分别为 ( 981 2 2 0 4± 12 3 5 35 7)、( 1375 8484± 2 44 4 718)、( 16 5 8 70 71± 176 9381)、( 2 35 3 0 86 3± 6 0 9 90 6 4) μg/ml ,与对照组 ( 6 6 6 8188± 14 1 330 2 ) μg/ml相比差异有显著性 (q test,P <0 0 5 )。结论　NGF可促进人RPE细胞增殖及促进细胞DNA合成。     

银杏叶提取物对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖、凋亡的影响

目的:研究不同浓度的银杏叶提取物(ginkgo biloba ex-tract,GBE)对体外培养的高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells,HRCECs)增殖和凋亡的影响。方法:体外培养从角膜移植术后新鲜人眼球提取的HRCECs。取生长良好的第3～4代细胞用于实验,实验分为低糖对照组、高糖对照组、高糖+不同浓度GBE组,用噻唑蓝(MTT)比色法检测HRCECs的增殖。吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)荧光双染色、流式细胞术检测HRCECs的凋亡率,并在荧光显微镜下观察荧光染色后HRCECs凋亡形态学改变。结果:MTT比色法结果显示:用12.5,25.0,50.0,100.0mg/L的GBE处理高糖环境下HRCECs,作用24,48,72h,高糖+不同浓度GBE组与高糖对照组相比具有显著性差异(P<0.05),高糖+不同浓度GBE组之间两两比较均具有显著性差异(P<0.05)。AO/EB荧光染色法、流式细胞术检测细胞凋亡率显示:高糖+不同浓度GBE组与高糖对照组比较均有显著性差异(P<0.05),高糖对照组显著高于低糖对照组(P<0.05)。荧光显微镜下观察到活细胞,早期凋亡细胞,晚期凋亡细胞,非凋亡的死亡细胞生物学形态改变的特征。结论:GBE促进高糖环境下HRCECs的增殖,抑制其凋亡。     

谷氨酸对视网膜Muller细胞超微结构和谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的探讨谷氨酸对大鼠视网膜Muller细胞超微结构和谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响。方法取5～7d清洁级Wistar乳鼠视网膜,在含质量分数10%新生牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中传代培养大鼠视网膜Muller细胞。第3代Muller细胞培养基中加入终浓度分别为10、20、50、100、200μmol/L的谷氨酸作用10min。正常对照组Muller细胞培养基中未加入谷氨酸。通过免疫细胞化学法检测GS的表达鉴定视网膜Muller细胞。透射电镜观察各组Muller细胞超微结构的改变。采用Westernblot法半定量检测GS的表达。结果培养的Muller细胞中,GS阳性细胞达95%以上。透射电镜下正常对照组Muller细胞超微结构正常,谷氨酸10、20、50μmol/L组Mller细胞超微结构无明显改变。100μmol/L谷氨酸组可见Muller细胞线粒体肿胀和染色质的凝集、边聚。在200μmol/L谷氨酸组可见Muller细胞空泡样变性和凋亡小体。Westernblot结果显示,10、20、50μmol/L组GS在Muller细胞中表达较正常对照组升高,差异均有统计学意义（q=29.32、q=75.54、q=48.36、q=130.20,P〈0.01）,50μmol/L谷氨酸组GS的表达达高峰,100μmol/L谷氨酸组表达开始下降,200μmol/L谷氨酸组的表达低于正常对照组（q=46.67,P〈0.01）。结论谷氨酸浓度影响视网膜Muller细胞中GS的表达,谷氨酸浓度超过50μmol/L可引起视网膜Muller细胞超微结构的改变。     

Effects of Nerve Growth Factor on Proliferation and DNA Synthesis of Cultured Human Fetal Retinal Pigment Epithelium Cells

Objective: To investigate the effects of nerve growth factor(NGF)on proliferation and DNA synthesis of cultured human fetal retinal pigment epithelium (RPE) cells in vitro. Methods: Primary culture and subculture of human fetal retinal pigment epithelium cells were established in vitro first. Cultured RPE cellswere treated with NGF by various concentrations 0μg/L, 50μg/L, 100μg/L,200μ,g/L and 300μg/L(final concentration) for 48 hs. After 48 hs, cells proliferation was measured with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay method and the amount of DNA was determined by the absorbance at 280 nm of nucleic acid & protein analysis.Results: The A values of 100μg/L, 200μg/L, 300μg/L NGF was(0. 213 7 ± 0. 233), (0.218 8 ±0. 018 1), (0.232 2 ±0.016 4) as compared with(0. 1897 ±0.0152) of A value of 0 μg/L NGF respectively, q value was 3.63,4.40,6.42 and P value was 0.015, 0.000, 0. 000(q-test).The DNA concentrations of 100μg/L, 200μg/L, 300μg/L and 400μg/L NGF was (981. 220 4±123. 5357), (1375.     

Human fetal retinal pigment epithelial cells induce apoptosis in the T-cell line Jurkat.

PURPOSE: To investigate the mechanism(s) involved in human fetal retinal pigment epithelium (HFRPE)-mediated T-cell death. METHODS: Pure HFRPE cells were isolated and cultured. Normal and interferon (IFN)-gamma-activated HFRPE from early and late in vitro passages were incubated with cells from the human T-cell leukemia line Jurkat (Jkt). Cultures were pulsed with [3H]-thymidine to measure Jkt cell proliferation. Jkt cells were evaluated for apoptosis either by staining with an ethidium bromide/acridine orange mixture (AO/EB) or with Annexin V-phycoerythrin. The role of Fas ligand (FasL) molecule in HFRPE-mediated apoptosis was assessed by using a mutant Jkt cell line (DD3), which is deficient in Fas-mediated signaling. The involvement of the antiapoptotic human gene bcl-xL was determined by using Jkt cells that were stably transfected with bcl-x(L). The role of cell- cell contact in the induction of apoptosis was evaluated in a transwell system in the presence or absence of neutralizing antibodies against IFN-gamma and tumor necrosis factor (TNF)-alpha. RESULTS: HFRPE cells inhibited the proliferation of Jkt cells by inducing apoptosis through a FasL-independent pathway. Passaging and IFN-gamma activation strengthened the inhibitory effect of HFRPE cells on the proliferation of Jkt cells. At lower HFRPE passages (P2), bcl-alphaL, overexpression rescued the HFRPE cell-mediated apoptosis. The separation of the cells by the transwell system did not affect the HFRPE cell-mediated suppression. This suppressive effect was not mediated by the secretion of IFN-gamma or TNF-alpha molecules. CONCLUSIONS: HFRPE cells suppressed the proliferation of Jkt cells by inducing apoptosis. HFRPE cells induced a stronger inhibitory effect on Jkt cells at higher in vitro passages. The HFRPE-induced apoptosis was not mediated through the FasL/Fas pathway or through the secretion of the apoptosis-inducing cytokines IFN-gamma and TNF-alpha. The bcl-xL gene may play a role in preventing HFRPE cell-induced apoptosis in Jkt cells. These combined results suggest that the HFRPE-mediated suppression of primary T cells may also be mediated by the induction of apoptosis. Therefore, the retinal pigment epithelium may play a role in the induction of immune privilege in the subretinal space.     

吡哆胺对AGEs干预的人RPE细胞的保护作用

目的：观察吡哆胺(PM)对高级糖基化终末产物(AGEs)干预的RPE细胞的影响,探讨PM对RPE细胞的保护作用。

方法：取传代至第3代的细胞进行分组：(1)对照组：含100mg/L BSA的DMEM培养基培养48h;(2)AGEs干预组：含200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h;(3)PM组：PM1组：含16mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h; PM2组：含32mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h。采用免疫组织化学法检测RAGE蛋白的表达; 荧光染色法观察细胞内ROS的生成; Tunel法检测细胞凋亡情况。

结果：AGEs可明显刺激RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS的生成,增加细胞凋亡情况,而PM可抑制该过程,且具有一定的浓度依赖性。

结论：PM能够抑制AGEs干预的RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS生成,减少细胞凋亡,具有一定的细胞保护作用。     

氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞增生及凋亡的影响

背景 氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)对家兔心肌细胞缺血-再灌注损伤时的细胞凋亡有促进作用,而小梁细胞上也存在ClC型氯离子通道及容积敏感性氯离子通道,但NPPB究竟会对小梁细胞的形态和功能产生什么影响尚不清楚. 目的 探讨氯离子通道阻滞剂NPPB对人眼小梁细胞增生及细胞周期、细胞凋亡的影响.方法 将处于对数生长期的永生株人眼小梁细胞进行培养并以1×106个/ml的密度接种于96孔培养板,将不同浓度(10、50、100 μmol/L)的NPPB分别加入小梁细胞培养基中,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组小梁细胞的增生情况以吸光度(A)值表示;采用流式细胞术测定小梁细胞的细胞周期.将100 mg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)加入培养的细胞中,而另一组培养的细胞中加入100 mg/L 5-FU+100μmol/L NPPB,用Annexin V-PI法检测各组小梁细胞的凋亡情况;罗丹明123法检测细胞线粒体膜电位(△ψm),分别评估各浓度NPPB对培养的人小梁细胞生长和存活的影响.结果 3种不同浓度的NPPB与小梁细胞共同孵育48 h后4个组小梁细胞的增生率差异有统计学意义(F=7.230,P=0.006),50 μmol/L、100μmoL/L NPPB作用后小梁细胞的A值明显低于10 μmol/L NPPB组,50 μmol/L NPPB组、100μmol/LNPPB组与空白对照组比较差异均有统计学意义(t=1.610,P=0.025;t=12.270,P=0.001).小梁细胞培养基中加入NPPB 48 h后,G0/G1期的细胞比例增多,S期细胞比例减少,各细胞周期小梁细胞的比例与未加NPPB的组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).用5-FU作用24 h及48 h后,100 mg/L 5-FU组和100 mg/L5-FU+100μmol/L NPPB组的细胞凋亡率均较其各自空白对照组增加(t24h=2.130,P=0.023;t48h=4.810,P=0.011);100 mg/L 5-FU+100 μmol/L NPPB组细胞凋亡率明显高于100 mg/L 5-FU组,差异均有统计学意义(t24h=1.980,P=0.037;t48h=1.290,P=0.028),小梁细胞线粒体膜电位降低,差异均有统计学意义(t24h=1.580,P=0.029;F48h=6.200,P=0.015).结论 氯离子通道阻滞剂NPPB可抑制小梁细胞增生,抑制小梁细胞通过G1/S期限制点进入S期;NPPB对5-FU诱导的小梁细胞凋亡有促进作用,与内源性线粒体凋亡通路相关.     

Human fetal retinal pigment epithelium-induced cell cycle arrest, loss of mitochondrial membrane potential and apoptosis

PURPOSE: To investigate the mechanism of action of the soluble immune suppressive product secreted by human fetal retinal pigment epithelial (HFRPE) cells in a model system using the human T-cell line Jurkat (Jkt). METHODS: Pure HFRPE cells were isolated and cultured. The supernatants of both nonactivated and IFN-gamma-activated HFRPE cells were isolated. Cells from the human T-cell line Jkt were incubated either in standard culture medium or in the supernatant isolated from HFRPE cells. In the first assay Jkt cell proliferation was measured by [(3)H]thymidine incorporation. In the second assay Jkt cell apoptosis was examined for annexin V staining by flow cytometry. In the third assay Jkt cell division was evaluated with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) fluorescent dye. In the last assay the mitochondrial transmembrane potential of Jkt cells was measured with the cationic lipophilic fluorochrome 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide [DiOC(6)]. In all the assays the effect of supernatants isolated from both nonactivated and IFN-gamma-activated HFRPE cells were compared with standard culture medium. The involvement of antiapoptotic human gene bcl-x(L:)was determined by using a Jkt cell line that was stably transfected with bcl-x(L:). RESULTS: The supernatant isolated from HFRPE cells significantly suppressed the cell division in Jkt cells and induced apoptosis. These effects were stronger when the supernatant was isolated from IFN-gamma-activated HFRPE cells. The apoptosis pathway induced by the secreted product of HFRPE cells involved the early disruption of mitochondrial transmembrane potential. Although the overexpression of bcl-x(L) gene rescued the Jkt cells from supernatant-induced apoptosis, it could not restore the proliferation of Jkt cells. CONCLUSIONS: These data suggest that HFRPE cells secrete a product that initiates an early cell cycle arrest in the human T-cell line Jkt, which is followed by the activation of an apoptotic pathway that involves the loss of mitochondrial membrane potential. The latter could be prevented by bcl-x(L) overexpression. Also these data suggest that the HFRPE-induced T-cell apoptosis may play a significant role in maintaining the immune privilege in the subretinal space.     

莱菔硫烷对过氧化氢诱导牛眼小梁细胞氧化应激损伤的保护作用

背景 研究表明小梁网组织的氧化应激损伤是开角型青光眼的基本病理过程之一,莱菔硫烷(SFN)可通过激活Nrf2/ARE通路发挥其抗氧化应激作用,但其是否可对氧化应激损伤的小梁细胞发挥作用目前尚不清楚. 目的 探讨SFN对H2O2诱导的牛眼小梁细胞氧化应激损伤的防护作用. 方法 采用组织块培养法对新鲜摘取的黑牛眼球小梁组织进行小梁细胞原代培养,将第3代牛小梁细胞以1x 103/孔的细胞密度接种于96孔板中培养24 h后将细胞分为4个组,空白对照组加入100μl无血清培养基,H2O2组细胞在空白对照组的基础上加入100 μl终浓度为100 μmol/L H2O2建立细胞氧化应激损伤模型,SFN组在培养液中加入100μl终浓度为10μmol/L SFN,而SFN+H2O2组在SFN组的基础上加入100 μmol/L H2O2,细胞培养后6h采用CCK-8法检测各组牛眼小梁细胞活力,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率.结果 传至第3代的细胞呈梭形,形状和大小较均一,细胞质丰富,可见色素颗粒,核仁大.H2O2组和SFN+H2O2组相对细胞活力分别为空白对照组的(67.00±1.27)％和(80.00±6.25)％,其中SFN+H2O2组相对细胞活力低于空白对照组和SFN组,但明显高于H2O2组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).空白对照组、H2O2组、SFN组和SFN+H2O2组细胞凋亡率分别为(11.33±0.77)％、(32.31±1.03)％、(10.44±0.68)％和(17.68±0.21)％,各组间总体比较差异均有统计学意义(F-539.96,P＜0.01),其中SFN+H2O2组细胞凋亡率明显低于H2O2组但高于空白对照组和SFN组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 SFN可以增强H2O2诱导的牛眼小梁细胞的抗氧化应激能力,减轻氧化应激对牛眼小梁细胞的损伤.