N-甲基-D天冬氨酸受体2B亚基重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的：构建携带N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体2B亚基（NR2B）基因的腺病毒5型（Ad5）穿梭载体，为NR2B重组腺病毒镇痛疫苗的包装做准备。方法：以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3．1-NR2B获得目的基因NR2B；将NR2B定向克隆入腺病毒穿梭载体pDC515，并行酶切及DNA测序鉴定。在脂质体介导下将pDC515-NR2B转染293细胞，并以RT-PCR及Western blot分别从转录水平和翻译水平检测目的基因NR2B的表达。结果：经酶切和DNA测序证实目的基因NR2B被成功克隆入载体pDC515-NR2B中，RT-PCR及Western blot检测NR2B可在293细胞表达。结论：成功构建NR2B重组Ad5穿梭载体pDC515-NR2B，该载体可用于NR2B重组Ad5载体镇痛疫苗的包装。     

伪狂犬病病毒Min-A株gE主要抗原表位基因的克隆与鉴定

目的：获得PRV gE主要抗原表位基因，构建PRV gE重组表达载体。方法：根据伪狂犬病病毒Min—A株gE基因序列，设计一对引物，采用PCR方法扩增PRV gE基因主要抗原表位区约642bp的片段，将产物克隆到PGEM-7Z载体中，测序正确后再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中，提取质粒作限制性内切酶分析和序列测定。结果：限制性核酸内切酶酶切鉴定表明，扩增出了PRV gE主要抗原表位基因，测序结果经BLAST分析与GenBank中注册的序列完全一致。结论：成功克隆了PRV gE主要抗原表位基因的原核表达载体。     

腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1的构建和鉴定

目的 构建腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2^ -IRES-hrGFP-1,为构建表达具有抗原表位标记的骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2),并同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告分子的腺病毒真核细胞表达载体打下基础。方法 对目的基因供体质粒pcDNA3-BMP2携带的BMP2基因测序和序列内部存在的限制性内切酶识别位点进行分析,利用PCR(polymeras chain reaction,PCR)技术对pcDNA3-BMP2携带的BMP2基因突变,以去除翻译终止密码子后的基因序列并添加新的酶切识别位点Xho Ⅰ。测序检测突变情况,将突变后的BMP2基因(BMP2^ 基因)定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1,通过限制性内切酶酶切图谱分析鉴定获得的重组质粒。结果 重组质粒经双酶切鉴定图谱正确。结论 成功构建了pShuttle CMV-BMP2^ -IRES-hrGFP-1。     

SARS S603-620表位核酸疫苗诱导BLAB/c小鼠产生特异性体液免疫应答

目的构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗并观察其免疫效果。方法将已经鉴定的SARSS抗原的B细胞表位S603-620的编码DNA序列插入真核表达载体PCI中,构建核酸疫苗(PCI-S603-620)。使用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,电泳及DNA测序鉴定。使用脂质体将PCI-S603-620转入293A细胞,使用ELISA检测其在真核细胞中的表达。使用PCI-S603-620免疫小鼠,ELISA检测其诱导的抗体情况。结果对PCI-S603-620进行酶切鉴定,电泳结果表明目的基因片段分子量为100bp左右。PCI-S603-620的DNA测序结果表明其序列与设计序列吻合。PCI-S603-620能在转染的293A细胞中表达。PCI-S603-620免疫小鼠可以诱导特异性抗体产生,效价为1:400。该抗体可以特异性识别SARSS抗原。结论成功构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗(PCI-S603-620)。     

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换

目的 以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗.方法 以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsAg/GPC3,将其插入pBSSK+载体中,构建出pBSSK/GPC3载体.利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗.结果 酶切和测序的结果显示序列无错配,获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-HBsAg/GPC3.结论 成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位,构建了pcDNA3-HBsAg/GPC3真核表达质粒.     

胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS-7细胞的表达

目的:构建含有胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因的腺病毒载体,并转染真核细胞COS-7.方法:多参数分析预测MUC4抗原HLA-A1、HLA-A2限制性CD8 T细胞表位kozac序列、引导序列以及通用Th表位PARDE和多表位基因串连后合成嵌合全基因.嵌合基因克隆到腺病毒穿梭载体pAdshuttle-CMV获得重组质粒pAdshuttle-CMV-PE.酶切鉴定后,将正确的重组质粒转化含有腺病毒骨架载体的BJ5183菌进行同源重组.Pac Ⅰ酶切和测序鉴定正确的重组子,脂质体介导转染Ad293细胞,通过观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒(rAd-PE).Ad293细胞反复感染冻融扩增病毒,流式细胞仪和TCID50检测病毒滴度.病毒颗粒感染COS-7细胞,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达以及SDS-Page分析多表位嵌合蛋白的表达.结果:成功构建了含有胰腺癌MUC4的多表位嵌合基因重组腺病毒,病毒滴度为1×1010 pfu/ml.SDS-Page发现在16 kD处有一符合预期大小的蛋白表达.结论:该重组腺病毒成功构建并能够在真核细胞COS-7中表达,为下一步胰腺癌的肿瘤疫苗研究奠定相应的基础.     

PcDNA3.1-rhGM-CSF重组质粒的构建及鉴定

目的:构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体。方法:采用PCR、T-A克隆及基因定向克隆技术,将rhGM-CSF基因插入PcDNA3.1(+)空载体,构建了PcDNA3.1-rhGM-CSF真核表达载体。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果:双酶切及DNA测序证实PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体构建成功。结论:成功构建PcDNA3.1-rhGM-CSF真核细胞表达载体。     

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

目的:构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TSO45-4B的真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B.方法:全基因合成TSO45-4B的基因序列,并利用PCR扩增该基因序列,将其插入真核表达载体pcDNA3.1,经酶切、测序鉴定.结果:经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因.结论:成功构建pcDNA3.1/TSO45-4B重组质粒.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因真核表达质粒pcDNA3.1/TSO45-4B的构建

目的：构建表达猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TS045-4B的真核表达质粒pcDNA3．1／TS045-4B。方法：全基因合成TSO45-4B的基因序列，并利用PCR扩增该基因序列，将其插入真核表达载体pcDNA3．1，经酶切、测序鉴定。结果：经酶切和测序鉴定表明所构建的重组表达质粒中含有TSO45-4B基因。结论：成功构建pcDNA3．1／TS045-4B重组质粒。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

人miR-106b的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的克隆微小RNAhsa—miR-106b并构建其慢病毒表达载体。方法将PCR扩增得到的miR-106b前体序列和pLVTHM载体经双酶切后连接,产生pLVTHM—miR-106b慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆。用pLVTHM—miR-106b、psPAX2和pMD2．G质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒。结果经双酶切鉴定和测序证实,成功构了miR-106b的慢病毒表达载体pLVTHM—miR-106b。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光。结论成功构建了has—miR-106b的慢病毒表达载体,为深入研究miR-106b的生物学功能奠定基础。     

MUC1黏蛋白模拟表位的筛选和原核表达

目的从噬菌体随机12肽库中筛选出MUC1抗原的模拟表位,构建MUC1模拟表位的原核表达载体.方法通过生物淘洗、基因测序和氨基酸序列比较,筛选出模拟表位,构建重组表达质粒PET-31b( ),用IPTG诱导表达,亲和层析纯化,Western blot鉴定其抗原性.结果筛选到的模拟表位与MUC1单克隆抗体的亲和力较强.成功构建了重组表达质粒,重组蛋白在BL21(DE3)plysS中得到诱导表达,纯化的目的蛋白在SDS-PAGE上呈现特异的单一条带,Western印迹也检测到目的蛋白特异条带.结论筛选到了MUC1的模拟表位,成功表达和纯化了MUC1模拟表位蛋白,为研究其在肿瘤疫苗方面的应用奠定基础.     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

Lactoferricin B基因与几种变异克隆的构建及其在酿酒酵母中的表达与鉴定

目的 构建牛乳铁多肽(Lactoferricin B)的真核表达质粒pYES2/Lactoferricin B,实现其在酿酒酵母S.cerevisiae中的表达,并初步检测其不同变异的体外抗菌活性.方法 通过分别合成Lactoferricin B基因两条单链的部分序列,让其互为模板、引物进行PCR扩增,得到Lactoferricin B与3种变异的基因序列.将它们克隆到穿梭质粒pYES2中,构建pYES2/Lactoferricin B 及3种变异基因重组质粒,转化到大肠杆菌Top10中,让其大量增殖.提取重组质粒经纯化后将其转化到S.cerevisiae中,通过营养缺陷型筛选获得重组酵母菌并通过半乳糖诱导使其表达目的蛋白.经离子交换柱纯化收集目的蛋白后,通过体外抑菌实验比较Lactoferricin B及3种变异重组蛋白的抗菌活性.结果 经PCR扩增检验、DNA测序表明成功构建pYES2/Lactoferricin B与3种变异基因重组质粒.提取诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及质谱检测,证实目的蛋白的存在,相对分子质量约为3.4×103.在大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌实验中观测到Lactoferricin B和A17-Lactoferricin B产生了抑菌圈.结论 成功构建pYES2/Lactoferricin B及变异基因重组质粒,该重组质粒能在S.cerevisiae中诱导表达目的蛋白,为进一步研究其生物功能及抗菌活性奠定了基础.     

促血管生成素-1腺病毒表达载体构建及鉴定

目的构建表达促血管生成素-1（Ang-1）的腺病毒载体,为研究Ang-1防治慢性缺血性疾病提供前期基础。方法通过PCR从pMD18-Ang-1质粒中扩增Ang-1基因,酶切连接入载体pDC315-GFP并转化大肠杆菌感受态细胞,PCR鉴定测序分析;借助AdMax腺病毒包装系统实现重组,提取质粒DNA并转染HEK293细胞,观察GFP荧光并以Western Blot检测目的蛋白的表达,以终点稀释法测定病毒滴度。结果重组质粒pDC315-GFP-Ang-1经PCR鉴定阳性克隆,测序分析比对正确,重组腺病毒转染HEK293细胞后可观察到GFP-Ang-1融合蛋白,病毒滴度1×1011PFU/ml。结论成功构建了表达Ang-1基因的腺病毒载体。     

磷脂酰肌醇激酶-3小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定靶向磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K） 亚单位编码基因PI3Kcb （catalytic,beta polypeptide）基因的小干扰RNA真核表达载体.方法：根据siRNA设计原则,在PI3Kcb mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体pDC316-EGFP-U6,重组后获得siRNA载体质粒pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,采用PCR检测和DNA测序以保证siRNA的方向和序列正确.结果：得到阳性重组克隆pDC316-PI3Kcb siRNA,经过PCR鉴定和测序,结果正确.结论：成功构建靶向PI3Kcb基因的siRNA载体pDC316-PI3Kcb siRNA-EGFP,为PI3Kcb的基因沉默研究奠定了可靠的基础.     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的: 构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品。方法: 用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果: PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上。结论: 本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品。