核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

基质金属蛋白酶抑制因子-1小干扰RNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)小干扰RNA慢病毒表达载体并转染肝星形细胞T6观测其转染效率及对TIMP-1mRNA的沉默效应。方法:用PCR扩增在线确定的TIMP-1特异性小干扰RNA序列,与T载体连接,用BamHI和XhoI分别双酶切并将其粘末端亚克隆入pRNAT-U6.2,用pR-NAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定并测序;包装产生TIMP-1pRNAT-U6.2/lentisiRNA的慢病毒表达载体,将其转染T6细胞,荧光照相及FQ-PCR检测转染效果及TIMP-1mRNA表达。结果:TIMP-1pRNAT-U6.2/LentisiRNA慢病毒表达载体可显著抑制T6TIMP-1mRNA表达。结论:成功构建能高效转染真核细胞的TIMP-1pRNAT-U6.2/LentisiRNA病毒表达载体,为进一步研究其在体抑制TIMP-1mRNA表达提供了实验工具。     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

同时沉默Livin基因和MTA1基因的siRNA载体的构建

目的:构建同时沉默Livin基因和MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)载体.方法:设计Livin和MTA1的siRNA靶序列,合成它们互补的寡核苷酸链,分别退火后重组入pRNAT-U6.2载体,得到pRNAT-U6.2-Livin和pRNAT-U6.2-MTA1.AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2-MTA1,回收475 bp的MTA1 siRNA单元,然后与XhoⅠ和PmeⅠ酶切线形化的pRNAT-U6.2-Livin重组,得到pRNAT-U6.2-Livin-MTA1,后者用脂质体包被转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR法分别检测转染细胞Livin和MTA1基因mRNA的表达情况.结果:针对Livin基因和MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段分别克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析插入片段正确.PCR扩增证实MTA1 siRNA单元重组入pRNAT-U6.2-Livin.RT-PCR检测显示,转染pRNAT-U6.2-Livin-MTA1的EC9706细胞Livin基因和MTA1基因mRNA表达水平皆明显降低.结论:同时沉默Livin基因和MTA1基因表达的siRNA载体构建成功.     

TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体.方法:提取胃癌组织总RNA,用TIMP-1基因引物进行RT-PCR,将扩增产物克隆至pGEM-T载体,PCR鉴定及测序证实后,BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切pGEM-T-TIMP-1重组体,回收TIMP-1,再将其亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C3中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析.结果:构建的pEGFP-C3-TIMP-1表达载体分别作PCR及双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与TIMP-1序列设计完全一致,将其转染人胃癌BGC-823细胞后,TIMP-1的表达定位在细胞胞浆内.结论:成功构建了TIMP-1绿色荧光蛋白真核表达载体,为TIMP-1的肿瘤靶向治疗研究奠定了基础.     

TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其对A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,观察其对人肺腺癌A549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α（NM₀00594）序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列（siTNF-α）和一对无关序列（siCon）。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染A549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组（FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05）。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默A549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。     

B72和hTERT的真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建同时表达B72和hTERT的真核表达载体.方法:根据GenBank中的序列,对B72、hTERT各设计一对两端带特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT-PCR后,将2扩增产物分别克隆在pGEM-T载体,然后双酶切各pGEM-T载体,回收目的片段,将2目的片段再克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,并对重组体进行PCR鉴定和测序分析.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,B72/hTERT真核表达载体构建成功,插入片段测序结果与GenBank公布的基因一致.结论:成功构建B72/hTERT真核表达载体.     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

针对大鼠ICOS基因的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠可诱导共刺激因子(inducible co-stimulater,ICOS)基因的特异性RNA干扰质粒,并进行鉴定.方法 采用U6启动子,分别把被9bp序列间隔的19bp长短的ICOS靶序列的反向重复序列,连接到线性化处理的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒中,分别构建ICOS短发夹环RNA(ShRNA),产生重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-ICOS.结果 将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,并作测序分析,经测序鉴定确定为所需序列.结论 针对大鼠ICOS基因的特异性RNA干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-ICOS的成功构建,为进一步研究阻断ICOS表达对实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)的影响奠定基础.     

组织蛋白酶L基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的RNA干扰真核表达载体.方法:根据GenBank数据库提供的CTSL基因核苷酸序列,设计并化学合成4对双链小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),瞬时转染卵巢癌细胞系A2780细胞,通过半定量RT-PCR检测各转染细胞CTSL表达筛选一个有效的siRNA序列.设计并合成能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs, shRNA)的DNA序列,并与psilence4.1-CMV-neo质粒定向连接,构建真核表达载体,DNA测序进行鉴定,并通过半定量RT-PCR验证其干扰效果.结果:构建CTSL的RNA干扰真核表达载体psilence4.1-CMV-neo-CTSL,经DNA测序证实与设计完全一致,通过半定量RT-PCR证实其能够沉默A2780细胞的CTSL基因表达.结论:CTSL基因RNA干扰真核细胞表达载体构建成功.     

~1PEP-1-p27mt融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自pORF9-hp27mtv21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-TEasy Vector。经XhoI和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化EcoliBL21(DE3)pLysS,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白。结论:PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

pmCherry-N1-WWOX真核表达载体的构建及其在胆管癌细胞QBC939中的表达

目的 构建人脆性位点抑癌基因WWOX真核表达载体,并观察其在人胆管癌细胞株QBC939中的表达.方法 通过全基因合成的WWOX cDNA为模版,用PCR技术扩增,将扩增片段连接到PUC57质粒,构建克隆载体,鉴定出阳性克隆后用 DNA测序法鉴定重组质粒.将克隆载体与pmCherry-N1同时用Xho I/BamH I双...     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

MAGE-3基因片段真核表达质粒的构建

目的克隆人MAGE-3基因片段，以构建真核重组表达质粒pcDNA3-1-MAGE-3，为制备以MAGE-3基因片段为基础的核酸疫苗及探讨相关的肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法RT—PCR法从肝癌组织制备出含BamHI、EcoRI酶切位点的MAGE-3基因片段，pGEM-TEasy为克隆载体，pcDNA3，1为真核表达载体，采用DNA重组技术，将目的基因先克隆至pGEM—TEasy载体再亚克隆至pcDNA3．1载体上，然后，据氨苄青酶素（Amp）抗性、蓝白筛选实验、克隆鉴定引物T7／SP6PCR扩增方法鉴定阳性克隆，并对阳性克隆pcDNA3．1-MAGE-3中的插入序列进行DNA测序。结果扩增出了MAGE-3目的基因片段；经蓝白筛选实验、克隆鉴定引物扩增方法鉴定得到重组子pGEM—T—MAGE-3；引物扩增方法鉴定得到重组子pcD—NA3，1-MAGE-3;DNA测序后与GenBank中MAGE-3相应序列比较，结果完全一致。结论成功构建了重组pcDNA3．1-MAGE-3肿瘤核酸疫苗，为肿瘤免疫治疗提供了条件。     

猪囊尾蚴GP50编码基因的克隆和序列分析

目的:从猪囊尾蚴cDNA中扩增出GP50编码基因,亚克隆至真核表达载体,利用所得的重组蛋白建立一种灵敏检测猪囊尾蚴感染的实验方法。方法:设计并合成引物,从猪囊尾蚴cDNA文库中PCR扩增GP50编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后,软件分析所获的目的基因。结果:PCR法扩增出897 bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-GP50作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,得到与PCR扩增产物一致的插入片断,表明GP50编码基因具有一个长度为897 bp的完整开放阅读框,编码298个氨基酸,相对分子量33 000,与GenBank收录(编号为AY212945)的猪囊尾蚴GP50编码基因具有高度的同源性(99%)。结论:猪囊尾蚴GP50编码基因的克隆获得成功。     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。