抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定

以初步纯化的人红细胞膜ＤＡＦ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,取免疫小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合,成功地获得３株（ＤＧ３、ＤＧ９和ＤＡ１１）抗人ＤＡＦ单克隆抗体。经间接ＥＬＩＳＡ测定,３株杂交瘤细胞培养上清及腹水的抗体效价分别为１０－３～１０－４及１０－６～１０－７;３株单抗的重链为小鼠ＩｇＧ１亚类,轻链为κ型。结合还原条件下的免疫印迹实验及３株单抗对ＤＡＦ促衰变活性的抑制作用,推测ＤＧ９识别的抗原表位为ＳＣＲ１,而ＤＧ３和ＤＡ１１为ＳＣＲ２至ＳＣＲ４。     

两株鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的: 制备鼠抗人PD-1单克隆抗体(mAb)及鉴定其生物学特性.方法: 以基因转染细胞PD-1/L929为免疫原, 免疫BALB/c小鼠;采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经选择性克隆化培养及流式细胞术(FCM)分析, 筛选分泌鼠抗人PD-1分子mAb的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、 Western blot、竞争结合抑制试验及肿瘤细胞株测定等方法对mAb进行生物学特性鉴定.结果: 获得了2株持续稳定分泌鼠抗人PD-1mAb的杂交瘤细胞株, 命名为1F2和5F10.对其生物学特性的鉴定结果表明, 均为条带相对分子质量在(Mr)55 000左右的免疫球蛋白, 具有不同的PD-1结合位点;1F2 mAb可识别SKHep-1和7721细胞株表面的PD-1分子, 而5F10可识别Raji细胞株的PD-1分子.结论: 成功获得了2株鼠抗人PD-1杂交瘤及其分泌的mAb.     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)的单克隆抗体(mAb).方法:利用从人工流产刮宫物中提取的HCG免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞同NS-1小鼠骨髓瘤细胞融合, 采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞株, 并对mAb的亚型、亲和力及特异性进行鉴定.结果:共获得26株能稳定分泌抗HCG特异性mAb的杂交瘤细胞株.mAb的亚类均为IgG1, 亲和力介于1.14×108～2.0×108 mol/L之间, 其中4株mAb与HCG的β亚基有较强的反应, 而与黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)均无交叉反应.结论:成功获得4株鼠抗人HCG mAb的杂交瘤细胞株, 其分泌的mAb能特异识别人HCG的β亚基, 可用于早孕、肿瘤等诊断的进一步研究.     

鼠抗人血管抑素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备鼠抗人血管抑素(angiostatin)的单克隆抗体,为进一步研究血管抑素的抗肿瘤作用和临床应用打下基础。方法:利用杂交瘤技术以血管抑素免疫BALB/C小鼠制备3株能够稳定分泌抗血管抑素抗体的杂交瘤,并对上清进行ELISA、双向免疫扩散等鉴定。结果:该抗体的类别为IgG₁,并能特异性识别血管抑素,与细胞因子rhIL-2、rhTNF-α、rhIFN-α及血清蛋白无交叉反应。结论:经初步鉴定获得3株分泌特异性抗血管抑素抗体的杂交瘤。     

抗人活化B淋巴细胞单克隆抗体制备及鉴定

自儿童手术摘除的新鲜扁桃体分离人Ｂ淋巴细胞，经ＰＭＡ（佛波醇）激活后得到人活化Ｂ淋巴细胞，用于免疫ＢＡＢＬ／Ｃ小鼠后，取免疫小鼠之脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，融合后细胞于含ＨＡＴ－ＩＭＤＭ完全培养基的２％甲基纤维素半固体培养基选择生长，经细胞酶联免疫吸附（ＣＥＬＩＳＡ）筛选间接免疫荧光流式细胞仪鉴定，获培养上清对活化Ｂ细胞及３Ｄ５细胞株细胞反应阳性，而Ｊｕｒｋａｔ细胞株细胞反应阴必的杂交     

抗人肺鳞癌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备和鉴定抗人肺鳞癌单克隆抗体(mAb),为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供候选抗体药物及为肺癌抗原的筛选提供工具。方法:用肺癌细胞株YTMLC-90做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,间接ELISA和有限稀释法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞获得mAb。染色体计数法鉴定杂交瘤细胞,并进行mAb同种型鉴定;对细胞培养上清液和腹水中的mAb采用间接ELISA法进行初步特异性检测及效价测定;采用Western blot法鉴定其与不同组织抗原结合活性;采用免疫组化染色法鉴定其在肺癌组织中的分布。结果:筛选出5株可稳定分泌抗肺鳞癌mAb的杂交瘤细胞株E2、F9、E11、D5和C6,分泌的抗体均为IgG1亚类,κ亚型。C6染色体数目为89～112条,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶1 004和1∶104,ELSA和Western blot结果显示其能特异性与肺癌细胞结合,未见与其他高发癌组织和正常组织结合。结论:成功地制备了能够特异识别肺癌组织的mAb。     

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:研制鼠抗人B7-H4分子的单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人B7-H4分子的转基因细胞L929/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交技术,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选、多次克隆化培养,获得两株可特异分泌鼠抗人B7-H4分子mAb的杂交瘤细胞株。采用快速定性试纸分析法鉴定mAb所属的Ig亚类。用Dot-blot、Western blot鉴定mAb的特异性,竞争结合抑制实验鉴定mAb所识别的抗原结合位点,T细胞增殖抑制阻断实验对mAb的生物学功能进行初步的鉴定。结果:获得两株持续、稳定地分泌抗B7-H4 mAb的杂交瘤细胞,分别命名为1F10和2B2。Dot-blot的结果显示,两株mAb均能特异性识别B7-H4分子。Westernblot检测显示,mAb 2B2可以特异性识别B7-H4分子,而mAb 1F10则不能识别。位点竞争实验表明,两株mAb之间,mAb 1F10与商品化的mAb H74之间识别位点不同,mAb 2B2与商品化mAb识别位点相近。T细胞增殖抑制阻断试验显示,这两株mAb均能一定程度地阻断B7-H4对T细胞的抑制作用。结论:成功地获得两株抗人B7-H4分子的mAb,为进一步研究B7-H4分子的生物学功能提供了有效的工具。     

抗硝基酪氨酸单克隆抗体的制备与鉴定

硝基酪氨酸 (nitrotyrosine ,NT)为活性氮 (reactivenitrogenspecies,RNS)对蛋白酪氨酸残基氧化修饰的产物 ,是体内RNS形成的重要生物标记物[1,2 ] 。目前 ,NT的检测主要采用HPLC、HPLC EC及GC MS等方法 ,需要大型仪器和专业人员操作 ,并需进行样品的预处理 ,费时费力 ;而且样品的处理过程还会人为地产生NT ,影响检测结果的准确性[3 ,4] 。免疫学技术为检测NT开辟了一条新的途径 ,将NT与载体蛋白的连接物作为免疫原 ,制备针对NT的mAb ,然后用于ELISA、Westernblot、免疫组化染色和免疫电镜研究。用ELISA法定量测定NT时 ,…     

抗阿莫西林单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

目的: 制备抗阿莫西林小鼠单克隆抗体(mAb),并初步鉴定其特性,为快速检测动物原性食品中残留的阿莫西林提供基础.方法: 将小分子的阿莫西林交联在大分子载体牛血清白蛋白(BSA)和匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)上,KLH交联物用于免疫BALB/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,通过融合,筛选制备抗阿莫西林mAb,并通过ELISA方法测定抗体亲和力,检测单抗与氨苄西林和头孢唑啉的交叉反应.结果: 通过ELISA筛选出5株可以稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,其亚型4株为IgG1/κ,1株为IgG2a/κ.亲和力在2.1×109~4.7×109.这5株mAb与氨苄西林的交叉反应为100%,与头孢唑啉没有交叉反应.结论: 获得5株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗阿莫西林抗体的杂交瘤细胞株,同时因为与氨苄西林的交叉反应为100%,这使得进一步研发动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林残留的免疫检测技术和产品成为可能.     

抗rhEPO单克隆抗体的制备及初步应用

目的 :研制抗人促红细胞生成素的特异性单克隆抗体 (mAb) ,对其生物学特性进行初步鉴定 ,并用于转基因羊乳中重组人促红细胞生成素 (rhEPO)的提纯。方法 :以自制的rhEPO粗品免疫BALB/c小鼠 ,制备抗rhEPO的mAb。以Westernblot和间接ELISA法 ,对所获mAb进行初步鉴定。以纯化的mAb同预活化的Sepharose 4B偶联 ,制得mAb亲和层析柱 ,并用于转基因羊乳中rhEPO的提纯。结果 :获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞株 (1E7和 2E6 )。Ig亚类 (型 )的鉴定分别为IgG1和IgG2b ,轻链均为κ型。用Westernblot证实 ,获得的mAb可特异性地识别rhEPO。用自制的免疫亲和层析柱用于转基因羊乳中rhEPO的提纯 ,具有很好的吸附作用 ,回收率达 70 %。结论 :成功地获得两株可分泌特异性抗rhEPO的mAb的杂交瘤细胞。用自制的免疫亲和层析柱提纯转基因羊奶中的rhEPO具有较高的吸附效率     

抗人S100A4单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备抗人S100A4单克隆抗体(mAb),建立检测肿瘤样品中S100A4蛋白的可靠方法.方法:采用标准杂交瘤技术得到抗重组人S100A4的mAb.以ELISA、Western blot和免疫组织化学法对抗体进行鉴定.并将抗体应用于临床人乳癌和结肠癌样品的免疫组织化学检测.结果:获得了1株稳定分泌抗人S100A4蛋白mAb的杂交瘤细胞株D101.在免疫印迹实验中,该mAb较多抗特异性更好.该mAb适用于来源于人组织的样品S100A4表达的检测,在少量乳癌和结肠癌样品的检测中给出的结果与商品化多抗的结果一致.结论:该mAb是S100A4特异的,在临床应用中有更好的重复性.     

抗牛碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的：制备抗牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAh)，并鉴定其亚类，建立ELISA检测bFGF含量的方法。方法：应用基因重组的牛bFGF免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合，建立分泌抗bFGF mAh的杂交瘤细胞株。应用免疫沉淀技术鉴定抗bFGF mAh的亚类；应用基因重组的牛bFGF免疫青紫蓝兔，制备抗bFGF的多抗血清；将抗bFGF mAb及兔抗血清用Protein A亲和层析纯化后，建立检测bFGF含量的ELISA方法。结果：共获得3株稳定分泌抗bFGF mAb的杂交瘤细胞株；它们所分泌的mAb均为IgG1；采用夹心ELISA法检测bFGF的敏感性达ng水平。结论：抗bFGF mAb(IgG1)和多克隆抗体制备为临床应用及相关研究提供了必要的试剂。     

抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果 获得1株可稳定分泌抗人PDC-E2 mAb 的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), 该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验.结论 成功制备了抗人PDC-E2的mAb,为PDC-E2的研究提供了有力的工具.     

抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及特性鉴定

目的:制备高效、特异的抗创伤弧菌的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用创伤弧菌菌体蛋白抗原免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备抗创伤弧菌的杂交瘤细胞株。用ELISA法及Western blot等筛选、鉴定其与创伤弧菌溶血素蛋白(vvhA)及其他重要海洋细菌的交叉反应性和效价。结果:共获得5株抗创伤弧菌的mAb,鉴定结果表明,5株mAb均具有良好的特异性和免疫反应性。结论:获得5株抗创伤弧菌的特异性mAb,为建立创伤弧菌快速检测试剂盒提供了重要制剂。     

抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法,对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株,其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法,该方法灵敏度达到870 U/L,平均回收率为107.81%,批内变异系数平均为6.7%,批间变异系数平均为9.3%,可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论:成功地制备了抗青霉素的mAb,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。     

抗人Flt-1单克隆抗体的制备和活性鉴定

目的:制备小鼠抗人血管内皮生长因子受体-1(Flt-1)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其免疫学特性。方法:以重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白为抗原,通过经典的杂交瘤制备和活性筛选方法建立能稳定分泌抗Flt-1蛋白的mAb杂交瘤细胞株。结果:经传统的小鼠腹水型抗体的制备和纯化方法获得了高纯度的抗人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb。ELISA方法测定出该抗体的免疫球蛋白亚型为IgG1,轻链为κ链。West-ern blot结果显示该抗体能特异性地识别重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白,FACS结果表明该抗体能结合到Flt-1阳性的脐静脉内皮细胞和K562/A02细胞表面,并呈现出抗体浓度依赖性。结论:成功建立了1株能够稳定分泌抗重组人Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的mAb细胞株XA12,为今后进一步开展Flt-1及其胞外Ⅲ区蛋白的生物学功能研究以及基因工程抗体研究奠定了基础。     

抗人精胺氧化酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备小鼠抗人精胺氧化酶(SMO)单克隆抗体(mAb),并验证其在Western blot,免疫组织化学等方法中的应用价值.方法:用pET-15b/SMO质粒转化BL2 (DE3)后,IPTG诱导表达带6×His标签的SMO重组蛋白并用Ni-NTA树脂亲和层析纯化.用SMO重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞杂交融合,获得能高效合成和分泌抗SMO mAb的杂交瘤细胞株.所得抗体的特异性和效价用ELISA和Western blot法以及免疫组织化学技术检测.结果:成功建立了稳定分泌鼠抗人SMO的mAb杂交瘤细胞株,获得的mAb效价高、特异性强,可用于ELISA,Western blot,免疫组织化学等分析技术.结论:成功制备出高特异性并能用于多种生物分析技术的SMO mAb.     

人SUMO1蛋白表达纯化及单克隆抗体的制备、鉴定

目的 表达重组人SUMO1(small ubiquitin-related modifier 1)蛋白并制备单克隆抗体.方法 构建含人SUMO1基因的重组表达质粒pET32a-HIS-SUMO1,在大肠杆菌中表达重组蛋白HIS-SUMO1;以纯化后的HIS-SUMO1蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术,通过ELISA和Western blot方法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,用免疫双向扩散法鉴定抗体Ig的类型及亚类;取一株筛选细胞按照常规方法制备腹水,利用Millipore抗体纯化试剂盒进行抗体纯化,Western blot方法检测抗体效价.结果 表达纯化了重组人HIS-SUMO1蛋白;3株稳定分泌特异性抗人SUMO1的单克隆抗体杂交瘤细胞株被筛选出,其免疫球蛋白类型均为IgG1类;通过腹水制备和纯化获得效价较高的鼠抗人SUMO1单克隆抗体.结论 通过表达纯化人SUMO1重组蛋白,制备出高效价鼠抗人SUMO1的单克隆抗体,该抗体可用于蛋白质SUMO化的研究.