siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展

目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体。其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

阳离子脂质体的研究进展

基因治疗面临的首要技术问题是基因药物的载体,目前用于基因治疗的载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.病毒载体虽然在基因转移方面具有一定的优点,但在体内具有较大的潜在危险,限制了它在临床基因治疗上的应用.非病毒载体中最具典型的是阳离子脂质体(cationic liposomes)载体,它具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点,近年来备受研究者的重视,至今已有数10种阳离子脂质体被研制合成出来.现就其进展综述如下.     

脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较

目的：对比脂质体与电穿孔法对 HepG2、SGC7901/ADM 两种细胞的转染效率。方法以 HepG2、SGC7901/ADM细胞为研究对象,采用脂质体法和电穿孔法分别转染pcDNA3．1‐EGFP质粒,流式细胞仪计算细胞存活率,借助绿色荧光标志蛋白eGFP测算转染效率。结果利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为（20．8±2．1）％,而电穿孔法转染效率增高至（49．6±2．5）％,二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901/ADM细胞所获得的阳性转染率为（25．4±1．3）％,而电穿孔法转染效率增高至（52．6±2．1）％,二者比较差异亦有统计学意义（P＜0．05）。结论使用电穿孔法能明显提高大片段载体的转染效率。     

优化阳离子脂质体介导的组织因子小干扰RNA转染HEK-293的转染条件

目的：优化lipofectamine^TM2000介导的组织因子（TF）小干扰RNA（siRNA）的转染条件。方法：化学合成法合成特异的TFsiRNA,利用绿色荧光蛋白（GFP）进行标记,分别将1．0μL和1．5μL的lipofectamine^TM2000与含有20、30、40、50、60pmol的TF siRNA混合液制备成相应的转染混合物,转染人胚胎肾细胞株（HKE-293）24h后,在荧光显微镜下计数阳性细胞率。同时,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测每组细胞活性。结果：转染效率和细胞活性与lipofectamine^TM2000以及siRNA有明显的交互作用,在1．0μL的lipofectamine^TM2000和50pmol siRNA转染HEK293细胞时,细胞转染效率最高,转染效率达（86．5±2．4）％,在1．5μL的lipofectamine^TM2000转染40pmol siRNA时,细胞活性为（86．0±7．8）％。结论：经优化转染条件后的lipofectamine^TM2000可高效的将化学合成的siRNA转染入HKE-293细胞株,且细胞活性达85％以上,为建立稳定的沉默转染体系提供实验基础。     

新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

目的新型阳离子核酸载体LW13-2进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法使用MTT比色法分析LW13-2与DNA在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒EGFP为报告基因,以人胚胎肾HEK293细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果当LW13-2与DNA的质量比为(1~3)∶1时,细胞毒性最低。LW13-2与DNA的质量比为3∶1时,转染作用4 h,在无血清培养基中继续培养48 h,得到LW13-2的最大转染效率为87.6%。结论通过与市售成熟转染试剂Lipofectamine 2000的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。     

自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的: 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法: 多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以3: 1摩尔比,制备多聚胺阳离子脂质体,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞存活分数,并以Lipofectamine2000为对照,评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果: 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000,但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论: 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体,在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.     

丁香多总皂对HBV转染细胞表达功能的影响

目的：观察丁香多总皂对HepG2．2．15细胞分泌HBeAg和HBsAg的影响．方法：采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养上清中HBeAg和HBsAg表达的变化并以抑制率来表示．结果：丁香多总皂对HBeAg和HBsAg的分泌具有抑制作用，该作用呈现剂量依赖性和时间依赖性。结论：丁香多总皂对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用提示其在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。     

pEGFP-NeuroD重组质粒在肝癌细胞中的表达及其功能探讨

目的:利用含绿色荧光蛋白的重组表达质粒pEG-FP-NeuroD做基因转染,观察其在肝癌细胞(HepG2)中的表达,探讨其在体外诱导肝细胞分泌胰岛素的可能性.方法:将酶切验证正确的重组质粒pEGFP-NeuroD,用脂质体法转染3种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞,荧光显微镜下观测各组绿色荧光蛋白的表达情况;采用RT-PCR方法检测HepG2细胞中NeuroD-1及insulin mRNA的表达;采用Western Blot方法检测EGFP-NeuroD融合蛋白的表达.结果:①重组质粒体外成功转染入HepG2细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,重组质粒转染率在30%～40%之间;②RT-PCR方法及Western Blot在3种不同葡萄糖浓度培养的细胞组中均榆测到NeuroD-EGFP融合蛋白的表达,其中RT-PCR方法扩增出NeuroD-1目的片段大小为634 bp,而融合蛋白Mr大小约为67×103,但是3组间蛋白表达量均无明显差异;③RT-PCR法未检测到肝癌细胞胰岛素的分泌.结论:重组表达质粒pEGFP-NeuroD可体外转染入HepG2细胞,功能探讨提示单一NeumD-1表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素.     

Interleukin-10 is expressed in HepG2.2.15 cells and regulated by STAT1 pathway

This study investigated the expression profiles of IL-10 gene in three human hepatoma cell lines including Huh7,HepG2,and HepG2 transfected with a plasmid containing hepatitis B virus (HBV) named HepG2...     

紫丁香叶提取物对HepG2.2.15细胞中HBeAg及HBsAg表达的影响

目的 :观察紫丁香叶提取物对 Hep G2 .2 .1 5细胞分泌 HBe Ag和 HBs Ag的影响。方法 :采用酶联免疫吸附法 ( ELISA)检测培养上清中 HBe Ag和 HBs Ag表达的变化并以抑制率来表示。结果 :紫丁香叶提取物对 HBe Ag和 HBs Ag的分泌具有抑制作用 ,该作用呈现剂量依赖性和时间依赖性。结论 :紫丁香叶提取物对 HBe Ag和 HBs Ag分泌的抑制作用提示其在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用     

天花粉提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

目的:探讨天花粉水提取物、醇提取物对HepG2.2.15细胞的增殖及培养细胞上清中HBsAg与HBeAg表达的影响。方法:用MTT方法检测HepG2.2.15细胞的存活率,以酶联免疫法(ELISA)检测HepG2.2.15细胞上清液HBsAg和HBeAg的表达量。结果:天花粉水提取物和醇提取物处理HepG2.2.15细胞后HBsAg和HBeAg的表达均呈时间依赖性和浓度依赖性抑制,但天花粉水提物的治疗指数明显优于醇提物。结论:天花粉水提物较醇提物有更好的抗HBV活性。     

蚕蛹水解氨基酸对人肝癌细胞 HepG2．2．15的体外抑制作用的研究

目的：探讨蚕蛹水解氨基酸对HepG2．2．15（人肝癌细胞株）在体外的抑制作用。方法运用MTT比色法测定蚕蛹水解氨基酸对人QSG-7701（正常肝脏细胞株）的毒性后,计算蚕蛹水解氨基酸的安全浓度。将蚕蛹水解氨基酸溶液分别配制成0．001 mg／ml、0．01 mg／ml、0．1 mg／ml、1 mg／ml和10 mg／ml的浓度,与HepG2．2．15细胞共同培养,实验同时设置空白对照和细胞对照组。每组设置4个复孔,每孔加入100μl的5×104个／ml的细胞悬液,于培养的24、48、72小时后,用MTT比色法测定OD值,评定蚕蛹水解氨基酸对HepG2．2．15细胞株的抑制作用。结果蚕蛹水解氨基酸的最大无毒浓度（TC0）为12 mg／ml。梯度浓度的蚕蛹水解氨基酸与HepG2．2．15细胞共同培养24、48和72 h后,与细胞对照组相比,OD值的差异有显著性（P＜0．05）,并有时间和浓度的线性关系。结论蚕蛹水解氨基酸对人肝癌细胞HepG2．2．15具有显著的抑制作用,且毒性较低。     

miR-122表达载体的构建及其对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用

目的构建miR-122表达载体并检测其表达对HepG2.2.15细胞恶性表型的逆转作用。方法以HepG2.2.15细胞基因组DNA为模板,PCR扩增miR-122前体cDNA序列,以质粒pSilencer3.1-H1 neo为母本,构建miR-122表达载体将其转染HepG2.2.15细胞。表达后,利用ELISA检测HepG2.2.15细胞HBV复制和表达的变化,利用CCK8检测细胞增殖的变化。结果构建的miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中表达。转染后HepG2.2.15细胞中HBV复制、表达以及细胞增殖均被抑制。结论 miR-122表达载体可在HepG2.2.15细胞中有效表达,其表达可抑制HBV复制、表达以及细胞增殖。     

黄芪提取物对乙型肝炎病毒抗原表达的抑制作用

目的探讨黄芪提取物对乙型肝炎病毒（HBV）病毒抗原表达的抑制作用。方法用MTT法测定黄芪提取液在不同浓度下对HepG2．2．15细胞的细胞毒性,ELISA法检测黄芪提取物对HepG2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒的影响。结果黄芪提取物对HepG2．2．15细胞4d和8d的半数毒性浓度（TC50）分别为88．914μg／ml和85．209μg／ml（P〉0．05）,对HBeAg4d和8d的治疗指数（TI）分别为1．018和1．342（P〉0．05）,对HBsAg4d和8d的治疗指数分别为0．065和0．089（P〉0．05）。结论黄芪提取物抑制HepG2．2．15细胞分泌HBeAg的作用为低效有毒,黄芪提取物对HBsAg抗原分泌无明显抑制作用。     

甘草甜素对HepG2.2.15细胞株HBeAg水平及TLR4表达的影响

目的 探讨甘草甜素(GL)时HepG2.2.15细胞上清HBeAg分泌,Toll样受体4(TLR 4)信号分子的表达及对细胞增殖的影响.方法 实时荧光定量PCR检测TLR4表达;直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR4的阳性细胞率;ELASA检测HBV所分泌抗原;MTT检测细胞增殖活性,并与空白对照组比较.结果 给药后HBV e抗原(HBeAg)的分泌结果显示,总体均数间差异显著(P<0.05),但甘草甜素各组与对照组比较差异无统计学意义;GL各组TLR4 mRNA及流式细胞TLR4的表达总体均数间均有显著差异(P<0.01),分别与对照组相比差异有显著性(P<0.01),100μg/mL组尤其明显;MTT实验显示,200μg/mL缸以下三个剂量组均可促进细胞增殖,50μg/mL组与对照组间差异显著(P<0.05);400μg/mL、800μg/mL两组均显著抑制细胞增殖(P<0.01);而MTT结果与HBeAg水平呈显著负相关(P<0.01),与TLR4表达无相关关系(P>0.05.结论 研究表明,甘草甜素对HepG2.2.15的e抗原分泌可能具有双向作用;细胞的存活率与e抗原呈负相关;TLR4在HepG2.2.15细胞株低表达,GL可上调TLR 4表达,甘草甜素可影响先天免疫中的TLR4信号分子,有可能在体内通过免疫途径影响HBV复制和抗原分泌.     

PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白基因的表达

目的：研究PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。方法：用脂质体转染法将增强型GFP基因转入PC12细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞GFP表达及荧光强度。用碘化丙啶(PI)标记缺氧血清剥夺再灌流后的PC12／GFP细胞,在流式细胞仪上分选GFP阳性(活)细胞并测定其比例。结果：克隆转移后几乎所有细胞表达GFP,可连续稳定传40代以上。流式细胞仪可精确分选出GFP( )／PI(-)、GFP( )／PI( )、GFP(-)／PI(-)、GFP(-)／PI( )4组细胞。结论：增强型GFP基因可在PC12细胞中稳定高表达。PC12／GFP细胞株的建立为短暂脑缺血再灌流后干预治疗的研究提供了理想的对照实验细胞模型。