重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价

目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术（RAA）检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA （18S rRNA）基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫( Plasmodium falciparum, P.f )、间日疟原虫( P. vivax, P.v)、三日疟原虫( P. malaria, P.m)、卵形疟原虫( P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫（婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫）,以评估该体系的灵敏度和特异度。 结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37 ℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10^-2 copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为10² copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。     

环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的研究

用环介导等温扩增技术(LAMP)快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌.利用铜绿假单胞菌gbca基因,特异性设计3对LAMP引物,在反应体系中添加羟基萘酚蓝(HNB)荧光染料,通过反应前后颜色的变化肉眼观察结果,并用琼脂糖凝胶电泳加以验证.对临床标本利用LAMP和PCR法平行检测,验证该法灵敏度、特异性.针对铜绿假单胞菌DNA特异性引物的LAMP法可以扩增,其他无扩增产物.本实验建立的LAMP法具备简便、快速、特异性强和灵敏度高的特点,适于实际应用.     

LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用

目的：建立一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,反应快速检测沙门茵的方法。方法：根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA（登录号：M90846和M18283）基因序列,设计特异引物,提取标本DNA,然后以LAMP技术扩增invA基因,PCR方法扩增厅棚基因,采用琼脂糖电泳观察结果。结果：91份血培养阳性报警瓶,LAMP和PCR法检测出阳性18份,与最终培养结果一致;30份粪便标本,LAMP和PCR法检测出阳性5份,培养阳性3份,LAMP测限达到10^2CFU／mL。结论：LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法。     

荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫方法的研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的恶性疟原虫的荧光定量环介导等温扩增检测方法。方法针对恶性疟原虫环子孢子蛋白（CSP）种属特异性基因保守区域8个位点设计3对引物,同时使用PCR法扩增恶性疟原虫219bp保守序列,经克隆后转化入工程菌株JM109感受态细胞中并提取重组质粒作为模板。以探索建立恶性疟原虫荧光定量环介导等温扩增检测技术,并对其试验重复性、灵敏度、特异性及适用性子以评估。结果在重组质粒浓度为1．06×10^4∽10^9拷贝／反应的范围内,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好线性关系（相关系数0．9995）,CT值变异系数为6．29％,无非特异性扩增,初步临床试验结果表明,试验的灵敏度为90．00％,特异度为93．33％,准确性为91．67％,试验可在30min内完成。结论荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫简便、快速、敏感,具有广阔的应用前景。     

荧光环介导等温扩增检测化脓性链球菌sdaB方法的建立

目的 建立荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法。方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列(GenBank:69901515),使用引物设计软件Primer Explorer V5.0获得LAMP引物。在LAMP体系中加入荧光染料,对引物、MgSO₄、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate, dNTP)、Bst DNA聚合酶的使用浓度进行了筛选,MgSO₄浓度范围为0～12 mmol/L、甜菜碱浓度范围为0～2.4 mol/L、dNTP浓度范围为0.2～2μmol/L、上游内部引物(forward inner primer, FIP)和下游内部引物(backward inner primer, BIP)浓度范围为0.2～2μmol/L、上游外部引物(forward outer primer, F3)和下游外部引物(backward outer primer, ...     

基于重组酶介导等温扩增技术检测人腺病毒4型方法的建立与评价

目的 基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)拟建立一种简单快速的人腺病毒4型(HAdV-4)检测方法。方法 以HAdV-4的六邻体(Hexon)基因为靶标设计特异性引物与探针,利用构建的阳性质粒标准品,在39℃、40℃、42℃条件下进行重组酶介导等温扩增,选出最佳反应温度,并对该方法进行灵敏度、重复性及特异性检测。使用实时荧光RAA测定法检测100份临床样本,并与实时荧光PCR检测结果进行比较,评估HAdV-4实时荧光RAA测定法在临床样本中的检测性能。结果 最终确定了实时荧光RAA扩增最适温度为42℃,该方法检测限为10¹ copies/μL。当质粒标准品浓度为10¹～10⁴ copies/μL时,批内的变异系数均<5%,重复性良好。特异性检测结果显示,该方法可以准确检测HAdV-4而不与其他亚型和其他病原体发生交叉反应。100例临床样本分别使用实时荧光PCR和实时荧光RAA测定法进行检测,两种方法的符合率为100%。结论 本研究开发了一种特异且简便的HAdV-4快速检测方法。     

淋病奈瑟菌porA基因实时荧光环介导等温扩增方法的建立

目的 运用实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速准确检测淋球菌的方法,以期用于淋病的早期临床诊断.方法 以淋球菌porA为靶基因,设计保守性和特异性良好的引物,以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,用23种其他在生殖系统中存在的微生物验证其灵敏度和特异性.结果 实时荧光LAMP法可检测到1 pg/μl(103CFU/ml)淋球菌基因组DNA,稳定性良好,其针对23种其他在生殖系统中存在的微生物均不能扩增,porA引物对淋球菌高度特异,阳性结果15 min可快速检出.结论 成功建立了检测淋球菌porA的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法.     

环介导等温扩增技术在寄生虫检测中的应用研究

随着分子生物学技术的快速发展,以检测核酸为基础的分子生物学技术如PCR、再生式序列复制以及链置换扩增技术等广泛应用于医学和生物学等领域,在病原体的检测以及疾病诊断方面发挥着重     

环介导等温扩增技术检测福氏志贺菌的实验研究

目的：了解并建立福氏志贺菌的快速、特异的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法,探讨快速、简便、有效的消化道传播性病原体的临床诊断、饮水检测和环境卫生监测等检测手段。方法对福氏志贺菌进行细菌培养,然后使用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和LAMP技术设计4条特异性引物,以及使用克隆等分子生物学方法进行DNA提取,然后对PCR方法与LAMP方法进行对比分析。结果LAMP扩增具有非常高的特异性,几乎不会产生非特异性扩增;与PCR方法相比,LAMP检测限更低,仅为5个拷贝;LAMP在等温条件下扩增,不会因温度改变而造成时间的损失,在1h内可将靶序列扩增至109～1010倍,并且不需要模板的热变性。结论 LAMP技术具有特异敏感简单的特点,不需要特殊的仪器,在65℃时1 h即可完成反应,同时检测结果可直接通过肉眼或加入荧光染料即可判断。     

环介导等温核酸扩增检测缓冲液成分的探索

目的 探索环介导等温扩增(LAMP)检测反应体系缓冲液,为我国野战/灾害等紧急输血的血液筛查提供技术支持.方法 通过对LAMP体系不同组分的梯度分析对检测结果的影响进行研究.结果 扩增效率随着反应体系内Mg2+浓度的增高而降低;LAMP反应的扩增效率随着反应体系内Betain浓度的增高而增高.随着Calcein浓度的降低,LAMP反应体系内的绿色荧光逐渐减弱.结论 建立的反应体系具有较好的反应灵敏度及特异性,与成品化的试剂相似,可适用于临床血液病原体筛查.     

树鼩粪便中沙门氏菌LAMP检测方法建立及应用

目的建立树鼩粪便沙门氏菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行初步应用。方法根据沙门氏菌种属特异性基因inv A(侵袭蛋白基因A)的保守序列,设计合成特异性LAMP引物。分别设定十个反应温度即57℃~66℃和十个反应时间即24~42 min进行优化,并测定本方法的特异性和灵敏度;同时进行普通PCR实验,作为本方法的验证和比较。用建立的LAMP法对91份野生来源的树鼩稀便样品进行检测。结果优化反应条件选出反应温度为62℃,反应时间34 min;该方法对沙门氏菌的灵敏度可达3.36×101CFU/m L,比普通PCR方法高10~100倍;对10种树鼩来源的肠道细菌进行LAMP检测,只有沙门氏菌属的肠炎沙门氏菌和乙型副伤寒沙门氏菌检测为阳性,其余为阴性;对91份野生树鼩粪便样品进行LAMP检测,阳性检出率为20.88%;LAMP法的所有反应可在40 min内完成。结果可通过肉眼观察颜色变化直接判定。结论所建立的LAMP方法具有便捷、快速、灵敏、特异等特点,可用于树鼩粪便中沙门氏菌的大规模快速检测。     

荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测田鼠巴贝虫方法建立及初步评价

目的 建立一类荧光重组酶聚合酶（recombinase polymerase amplification, RPA）扩增的田鼠巴贝虫快速检测方法并对该方法进行评价。方法 选择细胞色素B基因为靶序列,设计3组引物及荧光探针建立田鼠巴贝虫的检测方法并优化引物。设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃等6个温度梯度进行反应温度条件优化。将基因组DNA稀释至1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL等7个浓度梯度进行该方法的敏感性评价,采集恶性疟及间日疟患者血液样本进行特异性评价。取445 200、89 040、17 808、3 561.6、712.32、142.46、28.49、5.7、1.14、0.23不同田鼠巴贝虫载量的样本进行虫密度最低检测限实验。选取16例临床发热患者的血液样本进行荧光RPA与巢式PCR检测,评价结果一致性。结果 建立的荧光RPA法可特异扩增出150 bp的田鼠巴贝虫目的片段,最佳反应温度为39℃。该方法针对基因组DNA的检测敏感性最低可达10 fg/μL,不同田鼠巴贝虫密度样本...     

霍乱弧菌LAMP快速检测方法的建立及应用

目的 建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌.方法 针对霍乱弧菌外膜蛋白的ompW基因设计特异引物,优化反应条件,建立霍乱弧菌的LAMP检测方法.通过对47株细菌及模拟污染现场,检测该方法的灵敏度、特异度和实用性.结果 活菌计数方法表明建立的LAMP方法检测霍乱弧菌的灵敏度为1.6×10~2 cfu/ml.在人工污染霍乱弧菌的粪便及海水标本中检测的敏感度为1.6×10~3 cfu/ml,在牛奶标本中敏感度为1.6×10~4 cfu/ml.检测21株霍乱弧菌均为阳性,26株非霍乱菌则全部阴性,特异度为100%.结论 建立的LAMP方法检测霍乱弧菌灵敏度、特异度高,可用于霍乱现场监测和流行病学调查.

Abstract：

Objective To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Method Based on the ompW nucleic sequence of Vibrio cholerae, a pair of primers was designed for LAMP. The reaction conditions were optimized, and the specificity, sensitivity, and practicability of LAMP were tested using 47 baterial strains and simulated contaminated sites. Results The results of viable bacterium count showed that LAMP was capable of detecting Vibrio cholerae at a level as low as 1.6×10~2 cfu/ml. The minimal detectable concentration was 1.6×10~3 cfu/ml for simulated contaminated samples such as feces and seawater, and 1.6×10~4 cfu/ml for contaminated milk. All the 21 strains of Vibrio cholerae yielded positive results in LAMP, and the 26 strains of other bacteria all showed negative results, with a detection specificity of 100%. Conclusion The established LAMP method has high specificity and sensitivity for detecting Vibrio cholerae and is applicable in field monitoring and epidemiological study of Vibrio cholerae.     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

三联放大技术对HBV核酸检测的研究

目的：建立聚合酶链反应偶联印迹杂交和酶联放大技术（即三联放大技术）对乙型肝炎病毒的检测方法,探索适用于血液筛查乙肝的核酸检测技术。方法：通过检测HBV定值标准血清,评估三联放大技术检测血清HBVDNA的灵敏度。然后,应用三联放大技术对乌鲁木齐市500人（次）血清学检测病毒标志物阴性的献血者进行HBVDNA检测。结果：建立三联放大技术HBV检测体系,该体系对90IU／ml的HBV标准血清检出率为100％,对45IU／ml的HBV标准血清检出率为75％。对500人（次）血清学检测病毒标志物阴性的献血者,未检出HBVDNA阳性。结论：三联放大技术对HBV检测灵敏度较高,可运用于血液筛查乙型肝炎病毒。     

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展,介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。     

猫疱疹病毒Ⅰ型实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒I型(FHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,应用于实验用猫及临床患猫FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1 TK基因序列设计特异引物和Taq Man探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立FHV-1实时荧光定量PCR方法,并对方法的线性、特异性、敏感性、及稳定性等进行测定。用建立的方法对48份猫临床样品进行检测。结果成功建立FHV-1实时荧光定量PCR方法;该方法的线性范围为(1×102~1×109)copies/μL,与单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猫细小病毒(FPV)均无交叉反应,检测灵敏度可达到10 copies/μL。批内变异系数均小于5%。应用该方法从48份猫临床样本中检测出33份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的快速定量检测。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

双重PCR检测沙门氏菌和变形杆菌方法的建立

目的:建立快速鉴定腹泻患者粪便标本中和变形杆菌的双重聚合酶链式反应（PCR）方法。方法:针对沙门氏菌属特异基因invA和变形杆菌属特异基因tuf分别设计特异性引物,2013年5月-10月天津某医院肠道门诊腹泻患者粪便标本经SS培养基分离培养后,对可疑菌株同时进行invA-tuf基因双重PCR鉴定和生化鉴定,比较两种方法结果的一致性;对沙门氏菌进一步行血清学分型。结果:双重PCR和生化反应都各自鉴定得到沙门氏菌31株和变形杆菌62株,而且二者鉴定结果完全一致;31株沙门氏菌包括鼠伤寒、肠炎等常见血清型和格兰扁、菲尔摩雷等罕见血清型,均能扩增出283 bp长度片段,62株变形杆菌包括48株奇异变形杆菌、8株普通变形杆菌、2株潘氏变形杆菌、4株产黏液变形杆菌,均能扩增出541bp长度片段。 结论:invA-tuf基因双重PCR方法能够快速可靠地鉴定SS培养基上生长的沙门氏菌和变形杆菌。