幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp)细胞毒素相关蛋白（CagA)及粘膜免疫佐剂量霍乱毒素B亚单位（CTB）的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法：用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段，从霍乱弧菌扩增CTB基因片段，将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在JM109DE3中表达。结果：重组质粒pEGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符；各表达蛋白经SDS－PAGE分析，相对分子量与文献相符；重组蛋白经Westem blot检测有较强的抗原性。结论：基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备。     

表达HIV-1 gag-polΔ和gp140TM蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及免疫效果研究

目的 构建表达人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag-polΔ和gp140TM基因的非复制型重组腺病毒。方法 首先将HIV-1的gag-polΔ和gp140TM基因插入穿梭载体，再与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1共转化E．coli BJ5183，获得重组子。转化293细胞后获得重组病毒。重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫小鼠，ELISA检测小鼠血清中的抗体。结果 获得两株重组腺病毒vAd-gag-polΔ和vAd-gp140TM，能正确表达Gp140TM、Gag蛋白以及经剪切加工的P24蛋白，与DNA疫苗联合免疫小鼠后能产生高滴度的HIV-1特异性的抗体。结论 成功构建了表达HIV-1结构基因的重组腺病毒，能有效诱导HIV-1特异性抗体。     

幽门螺杆菌cagL基因缺失株的建立

目的:构建幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagL基因缺失株,为研究cagL基因的功能奠定基础。方法:利用同源重组原理,PCR扩增该基因编码区两侧序列,作为同源臂,构建出带卡那霉素抗性标志的载体,采用电穿孔法将其转化入受体菌中,并经PCR验证后获得了cagL基因缺失株;突变株和野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后,检测其对CagA蛋白转运的影响。结果:构建cagL基因缺失的自杀质粒,并获得一株cagL基因缺失株;CagA转运实验表明,cagL基因缺失后,导致幽门螺杆菌CagA转运功能的丧失。结论:成功获得了幽门螺杆菌cagL基因缺失株,该基因参与CagA蛋白的转运,是该菌IV型分泌系统中重要组成成分之一。     

流感病毒NA-C3d融合基因在非复制型重组腺病毒中的表达及其免疫效果的研究

目的 构建表达融合基因NA-C3d的非复制型重组腺病毒并研究其免疫效果.方法 将NA-C3d融合基因克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV,与腺病毒DNA共转化E.coli BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒并检测其免疫效果.结果 NA-C3d经PCR证实整合至腺病毒基因组中;重组病毒感染293细胞中经Wstern Bot检测到融合蛋白;重组病毒经滴鼻途径免疫小鼠,2次免疫后产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1∶1000和1:100000;经小剂量攻毒实验显示重组腺病毒保护率为100％.结论 成功构建表达NA-C3d的非复制型重组腺病毒,该病毒可诱导较好的免疫效果.     

表达HIV-1 gag-pol△和gp 140 TM蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及免疫效果研究

目的构建表达人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag-pol△和gp140TM基因的非复制型重组腺病毒.方法首先将HIV-1的gag-pol△和gp140TM基因插入穿梭载体,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,获得重组子.转化293细胞后获得重组病毒.重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中的抗体.结果获得两株重组腺病毒vAd-gag-pol△和vAd-gp140TM,能正确表达Gp140TM、Gag蛋白以及经剪切加工的P24蛋白,与DNA疫苗联合免疫小鼠后能产生高滴度的HIV-1特异性的抗体.结论成功构建了表达HIV-1结构基因的重组腺病毒,能有效诱导HIV-1特异性抗体.     

轮状病毒组特异性抗原VP6在重组腺病毒中的表达及其免疫学效果的研究

目的 构建可表达A组轮状病毒组特异性抗原VP6的非复制型重组腺病毒载体，并对其生物学和免疫学性质进行研究。方法 将人轮状病毒VP6基因插入腺病毒载体pShuttle-CMV中，通过细胞内同源重组方法获得重组腺病毒DNA，将其转染293细胞获得重组腺病毒。用聚合酶链反应（PCR）及Southern blot方法，检测目的基因在重组腺病毒中的整合，用Western blot检测VP6的表达。通过灌胃和滴鼻两种途径对小鼠进行免疫，并对免疫后小鼠体液和粘膜免疫进行分析。结果 得到了重组腺病毒rvAd-VP6,VP6基因整合于腺病毒基因且中，在293细胞中可稳定表达。2次免疫后灌胃和滴鼻两组小鼠均产生明显免疫应答，血清IgG抗体滴度分别为1：1000和1：10000－1：100000。除了血清IgG外，小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA，滴度为1：10－1：100。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到分泌型IgA(sIgA)，灌胃组仅在肠道检测到sIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。结论 人轮状病毒VP6基因重组腺病毒载体的成功构建及所取得的良好免疫学效果，为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒融合糖蛋白非复制型重组腺病毒的构建和表达

目的 构建含有A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)融合糖蛋白(Fusion glycoprotein,F)基因的非复制型第一代重组腺病毒(First generation odenovirns vector,FGAd),并研究F基因在重组腺病毒中的表达.方法 利用限制性内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ从质粒pGEM3zf-F中切下目的 基因F,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,再与pAdeaRy-1在大肠埃希菌BJ5183中进行同源重组,鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,Western Blot鉴定目的 基因表达.结果 获得了表达RSV F基因的非复制型重组腺病毒FGAd/F,Western Blot检测到F基因的表达.结论 获得一株可表达A亚型BSV F的非复制型重组腺病毒FGAd/F,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用.     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的 构建含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白.方法 PCR扩增,获得HIV-1 C亚型gp120片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd-gp120,PacⅠ酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd-gp120.结果 经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd-gp120重组腺病毒;通过Western 印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120 kD的蛋白.结论 成功构建了含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达.     

重组腺病毒载体vAd-tat的构建及其在细胞中的表达

目的 构建含HIV-1 tat基因重组腺病毒,观察在不同细胞中外源蛋白Tat的表达,作为DC抗HIV疫苗的基础.方法 通过PCR扩增,获得HXB2 tat的cDNA片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化含有腺病毒骨架pAd-easy-1的大肠杆菌BJ5183,获得同源重组的质粒prAd-tat,Pac Ⅰ酶切纯化后转染293细胞,包装成具有感染力的复制缺陷型重组腺病毒vAd-tat.结果 经PCR、酶切及DNA序列测定,插入片段大小、方向正确,获得具有感染力的含有HIV-1 tat基因的重组腺病毒;通过Western blot方法 检测,重组腺病毒在293细胞中表达出Mr,为15 000的蛋白.结论 成功构建了含有HIV-1 tat基因的腺病毒,并观察到该基冈在细胞中的表达.     

人轮状病毒G2和G3型主要中和抗原VP7基因在重组腺病毒中的表达

目的 研究我国G2和G3型轮状病毒主要中和抗原VP7基因在重组腺病毒中的表达。方法 在前期成功表达Gl型VP7的基础上，选用我国G2和G3型主要流行株97S43和97S48 VP7基因，用非复制型腺病毒载体对上述基因进行表达。结果 获得了表达我国G2型和G3型人轮状病毒流行株VP7基因的非复制型重组腺病毒rvAdG2VP7和rvAdG3VP7，应用PCR及Southem blot技术证实在重组腺病毒中整合有轮状病毒G2型VP7和G3型VP7基因，RT-PCR证明重组腺病毒在感染的293细胞内均能有效地转录插入基因，Western blot检测到轮状病毒VP7基因的表达。结论 这一工作为进一步进行动物实验，发展多价轮状病毒疫苗打下了基础。     

BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达

目的:利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体(proBDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)高效表达。方法:采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-proBDNF和pAdTrack-BDNF,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-proBDNF和pAd-BDNF;转染293细胞,包装成重组病毒颗粒;将重组病毒上清感染rMSC,用荧光显微镜下观察和Western-blotting鉴定重组病毒在rMSC表达;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内,两周后荧光显微镜下直接观察。结果:成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能,体内移植实验表明Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论:重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率,带有报告基因EGFP的Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

重组腺病毒介导的转录因子Runx3在神经胶质瘤细胞中的表达及其亚细胞定位

目的:制备含有融合Flag标签的Runx3基因的复制缺陷型重组腺病毒,感染神经胶质细胞瘤U251,观察外源Runx3在细胞中的表达及亚细胞定位.方法:用PCR的方法扩增Runx3基因,并将Flag标签蛋白的编码基因与RUNX3基因进行融合,构建腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-Runx3,经Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切鉴定并测序.利用电转化方法将经Pme Ⅰ线性化的pShuttle-CMV-Runx3穿梭载体导入BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒Ad-Runx3,再将经Pac Ⅰ线性化的Ad-Runx3重组病毒骨架质粒转染293A包装细胞,包装并扩增病毒.利用该病毒感染神经胶质细胞瘤U251,用免疫印迹法观察外源Runx3在细胞中的表达,用间接免疫荧光法观察其在细胞内的定位.结果:构建并包装表达Runx3蛋白的重组腺病毒,用重组腺病毒感染U251细胞后,经免疫印迹和间接免疫荧光法检测,可见外源导入的Runx3蛋白在细胞核内的特异性定位.结论:成功制备了含有融合Flag标签的转录因子Runx3基因的重组腺病毒,感染U251细胞,在细胞中观察到该分子表达后定位于细胞核中,为研究Runx3在神经胶质瘤发生中的作用奠定了实验基础.     

诺如病毒衣壳蛋白重组人3型腺病毒的构建

目的 制备表达诺如病毒衣壳蛋白的重组人3型腺病毒.方法 将诺如病毒衣壳蛋白基因(Noro-orf2)克隆到腺病毒穿梭载体pBSE3CMV-egfp上,与线性化人3型腺病毒骨架质粒pBRAdv3共电转化感受态大肠杆菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,带Noro-orf2基因的表达框置换腺病毒E3区,PCR及酶切筛选得到重组腺病毒质粒,将重组腺病毒质粒转染Hep-2细胞进行包装,获得感染性的重组腺病毒粒子,免疫组化分析重组腺病毒中诺如病毒衣壳蛋白的表达.结果 同源重组后经酶切和PCR鉴定证明插入Noro-orf2基因的重组腺病毒质粒pBRAdv3E3dNor成功构建,并经转染包装得到高滴度的重组腺病毒Adv3E3dNor,免疫组化证明诺如病毒衣壳蛋白得到表达.结论 成功构建表达诺如病毒衣壳蛋白的重组3型腺病毒Adv3E3dNor,为研制人3型腺病毒-诺如病毒双价疫苗奠定了基础.     

人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

目的: 构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达。方法: 从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pmeⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a。将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒。将重组腺病毒感染hMSCs，利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达。结果: 限制性内切酶分析和DNA测序结果显示，重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a。rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强。结论: 成功构建了人miR-133a 重组腺病毒，并在hMSCs中高效表达出miR-133a，为进行miR-133a的功能研究创造条件。     

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。     

人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：人端粒酶催化亚基与c-myc在喉鳞状细胞癌中有密切的相关性。 目的：构建含有c-myc启动子的人端粒酶催化亚基的重组腺病毒载体,观察人端粒酶催化亚基在细胞中表达后对细胞增长的影响。 方法：按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物,用复式PCR获得目的片段ashTERT(322 bp)。将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7 kb)克隆载体,然后热激转化到E.coli感受态细胞中,菌检、PCR、鉴定阳性克隆后,菌液放大培养,提取质粒pUC57-ashTERT,然后对质粒进行测序。将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pshuttle-CMVneo上,然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。 结果与结论：提取质粒pUC57-ashTERT,测序符合序列要求。质粒pUC57-ashTERT转入293细胞后,成功构建了有较强感染能力的含人端粒酶催化亚基基因的重组腺病毒载体。     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。     

人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响

目的构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响。方法采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE。经测序检测后,用PmeI酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。经PacI酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒。利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度。用Western blot检测目的基因的表达。采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响。结果成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体。Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达。收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL。转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少。结论hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用。