骨髓干细胞和脂肪干细胞对纳米磁铁颗粒的摄取性能研究

目的 研究两种纳米磁性氧化铁颗粒分别与骨髓干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)和脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养时细胞对磁铁颗粒的摄取情况,以初步探讨其作为磁共振成像(MRI)对比剂去标记组织工程种子细胞而进行MRI示踪的可行性.方法 制备粒径为6 nm的Fe3O4磁性颗粒及经聚L-乳酸(PLLA)表面修饰的Fe3O4磁性颗粒(200 nm),分别在细胞接种时及接种后24小时两种方式加入.使用电感耦合等离子体质谱(ICP-OES)检测细胞对铁颗粒的摄取量.结果 细胞对铁颗粒的摄取量受纳米磁铁颗粒的种类,加入方式和细胞类型的影响.BMSCs和ADSCs对6 nm粒径磁铁颗粒的摄取量显著高于对200 nm铁颗粒的摄取量,而ADSCs摄取的量又高于BMSCs.结论 6 nm粒径的磁性氧化铁颗粒可以较好的被BMSCs和ADSCs吸收,具有良好的生物相容性,有望成为组织工程种子细胞的标记物来进行MRI示踪.     

骨髓基质干细胞靶向胶质瘤迁徙的研究

目的探讨骨髓基质干细胞(MSCs)向胶质瘤迁徙的能力及其分布模式。方法应用纳米超顺磁性氧化铁粒子(SPIO)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双重标记大鼠MSCs,Transwell系统定量分析MSCs的迁徙能力。将标记的MSCs经静脉注射人胶质瘤荷瘤大鼠体内,普鲁士蓝和荧光染色检测MSCs靶向颅内胶质瘤迁移的分布模式。结果与生理盐水或正常脑组织溶解物比较,F98胶质瘤细胞和F98胶质瘤溶解物显著诱导MSCs向其迁徙(P<0.01)。F98胶质瘤细胞显著刺激MSCs的迁徙(三倍于对照组),而F98胶质瘤溶解物具有最强的诱导MSCs迁徙的能力(五倍于对照组)。移植MSCs后第7天,SPIO/EGFP双标细胞散在分布于肿瘤中;第14天,绝大多数标记的MSCs位于肿瘤和正常脑组织之间沿肿瘤边界分布。结论系统移植的MSCs高度特异性地向颅内胶质瘤"归巢",呈时空分布模式。     

自体干细胞移植治疗兔后肢缺血中超顺磁氧化铁纳米颗粒标记磁共振体内示踪的研究

目的探讨自体骨髓间充质干细胞（BMSC）移植治疗兔后肢缺血中超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPION）标记磁共振成像（MRI）体内示踪的可行性和有效性。方法新西兰大白兔14只，分成A、B两组，各7只。制作后肢缺血模型。A组移植SPION与5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）共标记的自体BMSC；B组作为对照。术后MRI示踪，组织学检查，免疫组织化学染色。结果鉴定显示BMSCCD34和CIM5阴性，CD44阳性。B组中1只死亡。A组毛细血管密度198．9±2．3，B组80．5±5．1．A组毛细血管／肌纤维比值0．84±0．03，B组0．35±0．04，两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。A组：电镜发现血管内皮细胞胞质内含SPION；对应部位组织切片血管壁细胞普鲁士兰铁染色、BrdU和CD34染色均阳性；MRI显示术后即时A组注射部位圆形低信号影，术后1—3周向周围扩散，部位与组织学检查结果一致。B组仅能见到普鲁士兰阳性颗粒游离于组织间隙，并非位于血管内皮细胞；MRI低信号影局限于注射局部，无扩散。结论自体BMSC移植治疗兔后肢缺血中SPION标记MRJ体内示踪可行、有效。     

菲立磁细胞内标记兔骨髓基质细胞的初步观察

目的:探讨利用菲立磁(Fefidex)和转染试剂体外标记兔骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像(MRI)追踪标记细胞奠定基础.方法:9只2月龄新西兰大白兔无菌条件下行股骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获取兔骨髓基质细胞,用菲立磁-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)标记骨髓基质细胞,采用普鲁士蓝染色和台盼蓝拒染实验等方法鉴定FE-PLL标记兔骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并在增殖条件下用改良SABC法进行抗单克隆神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色(DAB-H<,2>O<,2>棕色法呈色)和普鲁士蓝(Prussian blue)染色.对FE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估.结果:菲立磁可以高效率地标记兔骨髓基质细胞,标记效率在99%左右.普鲁士蓝染色显示FE-PIJL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒.标记的骨髓基质细胞与正常未标记细胞相比较,细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的差异.结论:菲立磁可以用来体外标记骨髓基质细胞,标记后对骨髓基质细胞活力、增殖和分化能力无明显影响.     

成人骨髓基质干细胞的体外培养及初步诱导分化研究

目的:探讨体外培养人骨髓基质干细胞(BMSC)的方法和初步诱导BMSC向神经细胞方向分化的方法。方法:采用正常成人献髓者骨髓,分离扩增BMSC,原代培养后将传1～4代细胞按1×104/ml种于24孔板,绘制生长曲线、贴壁率,观察细胞生长及不同浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)对BMSC的作用。以全反式维甲酸(RA)和bFGF为诱导剂,观察诱导前后BMSC的变化。结果:原代BMSC生长状态良好,传至第5代仍保持干细胞特性,bFGF可明显促进BMSC增殖,且呈剂量依赖关系。RA和bFGF诱导12h,BMSC逐渐向神经样细胞转化,胞体收缩成锥形、三角形或不规则形,细胞伸出细长突起,免疫细胞化学鉴定呈Nestin阴性,NSE阳性,GFAP阳性,且NSE阳性细胞数较GFAP阳性为少。结论:BMSC可在体外稳定扩增,且能保持干细胞特性,RA和bFGF可诱导其分化为神经细胞。     

纳米组织工程骨与兔骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的探讨纳米组织工程骨(NHAC)与兔骨髓基质干细胞(RMSCs)体外生物相容性,为应用组织工程方法修复骨缺损提供依据。方法将RMSCs与NHAC体外复合培养,进行形态学和功能测定。结果骨髓基质干细胞能在纳米组织工程骨上良好地粘附、增殖、生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到纳米组织工程骨的影响。结论NHAC具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的生物材料。     

骨髓基质干细胞治疗兔缺血心肌的初步实验研究

目的通过建立兔自体骨髓移植模型,验证骨髓基质干细胞(MSCs)移植到缺血心肌后是否在心肌的微环境中可以向心肌细胞分化,探讨其对缺血心肌心功能的影响。方法将13只新西兰大白兔分为实验组(7只)和对照组(6只),实验组于心肌梗死前后缘上、中、下各3点分别注射被5溴-2脱氧尿苷(BrdU)标记的自体MSCs(3×106cells/30μl);对照组注射同等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。移植4周后通过激光共聚焦显微镜验证移植后的MSCs是否向心肌细胞分化,并用心脏彩色超声心动图和多导生理记录仪测定缺血心肌的心功能。结果移植4周后,MSCs向心肌细胞分化,表达出α-肌小节肌动蛋白(-αsarcomeric actin)和存在于闰盘中的连接蛋白43(connexin 43),自体MSCs能够增加局部心肌组织中血管数量。实验组心肌左心室收缩功能明显比对照组增强[左心室射血分数(LVEF):0.51±0.07 vs.0.43±0.06,左心室侧壁运动幅度(LVLWMD):1.75±0.42mm vs.1.09±0.28mm,左心室收缩期室壁增厚率(LVΔT):0.19%±0.05%vs.0.11%±0.04%,左心室收缩压(LVSP):113.1±6.3 mmHg vs.99.5±5.1 mmHg,左心室舒张期末压(LVEDP):11.5±2.1 mmHg vs.14.3±3.1mmHg,左心室压力增高最大速率(+dp/dtmax):4 618.3±365.2mmHg/s vs.3 268.1±436.9 mmHg/s,左心室压力下降最大速率(-dp/dtmax):3 008.8±346.7mmHg/s vs.2 536.9±380.4 mmHg/s,P<0.05]。结论自体MSCs移植到兔缺血心肌后可以向心肌细胞分化,提高缺血心肌的心功能,对治疗心肌缺血具有较好的前景。     

磁性纳米颗粒在干细胞的应用研究

磁性材料是一种古老而用途广泛的功能材料.1960年Feeman等[1]提出铁磁性粒子可以通过血液循环系统和外界磁场的协同作用下到达身体的某一特定组织.磁性纳米颗粒是包被葡聚糖等不同生物大分子衣的纳米级氧化铁胶体溶液,具有高热稳定性、低毒性和超顺磁性[2].     

钴铬钼颗粒对大鼠骨髓基质干细胞cbfalmRNA的抑制

目的:探讨钴铬钼(Co-Cr-Mo)颗粒对大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)成骨特异性转录因子cbfal(corebinding factor a l)mRNA的影响。方法:条件培养液(含0.00％、0.005％和0.001％的Co-Cr-Mo颗粒)干预第7d与第14d细胞,Annexin V法检测凋亡率、RT-PCR和原位杂交检测cbfalmRNA变化,结果:随着培养时间延长和颗粒浓度增加,BMSC凋亡率增加,cbfalmRNA表达减少,与对照组显著差异(P<0.05),cbfalmRNA阳性细胞数目降低,与对照组显著差异(P<0.05)。结论:Co-Cr-Mo颗粒引起BMSC的cbfalmRNA减少,降低其成骨分化能力。     

骨髓基质干细胞及其应用研究进展

骨髓基质干细胞(BMSCs)作为一种干细胞，由于具有很强的自我更新能力和多分化潜能，近年来引起了广泛的注意，体内外试验中已发现BMSCs可以分化为骨组织和软骨组织、神经组织等组织的细胞，并且具有修复以上各组织缺损的能力；同时发现BMSCs是一种理想的基因载体，从而达到基因治疗的目的。本文旨在对BMSCs的分离、培养、生物学特性、基因治疗及其组织修复中的应用研究进展作一综述。     

骨髓基质干细胞扩增体系研究

目的 比较三种不同培养体系对人骨髓基质干细胞(h BMSCs)增殖能力、表面标志和分化潜能的影响,探索h BMSCs适合的培养体系。方法 获取h BMSCs,分别用DMEM、DMEM+碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和无动物组份的间充质干细胞培养基(Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free,MSCM-acf)进行培养,反复传代至第6代,分别计数每种培养体系每个代次的细胞得率。取第4~6代细胞,用流式细胞仪对细胞表面标志进行检测,同时对各组第6代细胞分别向成软骨、成脂和成骨方向进行诱导分化。结果 培养至第2代后,MSCM-acf培养体系细胞得率显著大于其他两组;流式细胞分析结果表明,MSCM-acf培养体系表面阳性标志CD73、CD90和CD105均大于99%,总的阴性标志表达小于2%,优于其他两组,尤其是DMEM+b FGF培养体系;三组均保留了多向分化潜能,添加b FGF的培养体系成软骨分化明显优于其他两组,MSCM-acf培养体系成脂和成骨分化优于其他两组。结论 MSCM-acf培养体系可以实现h BMSCs干性维持下的大量扩增,是h BMSCs较为理想的培养体系。     

人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs）与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）体外共培养对hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影响。方法分离鉴定hBMSCs和hUVECs,将hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培养,倒置相差显微镜观察细胞的生长特性和细胞相容性,Matrigel实验观察共培养对hUVECs体外血管形成能力的影响。将hBMSCs成骨诱导7 d后,茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。结果 hBMSCs与hUVECs体外共培养细胞相容性良好,Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的hBMSCs中,共培养组茜素红染色阳性,单一细胞组茜素红染色阴性。结论 hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性,在共培养体系中,未诱导的hBMSCs能促进形成毛细血管状结构,已成骨诱导的hBMSCs成骨矿化能力增强。     

小鼠骨髓干细胞参与肾小管上皮细胞更新的实验研究

目的：观察骨髓来源的干细胞能否分化成肾小管上皮细胞，深化对骨髓干细胞可塑性的认识。方法：绿色荧光蛋白标记的C57BL／6转基因小鼠提供骨髓，同种无荧光的C57BL／6小鼠经致死剂量7射线全身均匀照射后接受骨髓移植，分别在移植后第56d、84d处死，采用荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察绿色荧光在骨髓移植小鼠肾脏肾小管的分布及数量，观察骨髓干细胞在无损伤的小鼠肾脏中的分化。结果：骨髓移植后56d、84d的小鼠肾小管中有少量绿色荧光蛋白阳性细胞存在。激光共聚焦显微镜进一步证实这些细胞位于肾小管，并表达肾小管上皮细胞特异性的功能蛋白megalin。结论：骨髓干细胞可能参与肾小管上皮细胞的更新。     

一种从骨髓血凝块中分离间充质干细胞的方法

目的 探讨一种从骨髓血凝块中分离培养间充质干细胞的简易方法.方法 采集肝素化骨髓标本7份,部分加入凝血酶以模拟血液凝固过程,并于0、8和16 h分别使用尿激酶或机械处理,分为尿激酶处理组、机械处理组、凝固未处理组及未凝固对照组.各组标本经氯化铵溶解红细胞后,分别进行成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)和MSC传代培养.计每组CFU-F及第0、1和2代MSC数量.流式细胞仪测定细胞表型,组织化学法检测细胞体外成骨和成脂肪能力.结果 尿激酶处理组样本CFU-F数平均为(33.71±23.54),接近于未凝固对照组样本(40.43±21.29)(n=7,P＞0.05),显著高于机械法处理组(13±11.91)(n=7,P＜0.01)和凝固未处理组(3.71±3.89)(n=7,P＜0.01).储存8或16h后的标本,各组CFU-F形成能力下降,而未凝固对照组和尿激酶处理组数量仍显著高于另外两组(P＜0.05).标本储存不同时间进行MSC传代培养,未凝固对照组及尿激酶处理组细胞数量无明显差别,但均显著高于凝固未处理组及机械处理组.各组MSC均表达CD73和CD90,不表达CD31和CD45.经特异诱导后,各组MSC均呈现碱性磷酸酶活性,细胞内出现亲油红O染料的脂肪滴.结论 对于已经凝固的骨髓标本而言,尿激酶预处理是分离培养MSC的良好途径.     

大鼠骨髓基质细胞的体外培养

目的：观察大鼠骨髓基质细胞在体外培养的条件,为骨组织工程学研究奠定一定实验基础。方法：取幼年SD大鼠,处死后分离骨髓,原代培养骨髓基质细胞,传代后分别观察其生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果：大鼠骨髓基质细胞在第7代以前生长形状相对稳定,生长曲线相似;第4d分裂指数最高,为16％;传代后12h贴壁率最高,为90％。结论：本实验方法中,骨髓基质细胞在体外培养条件下,早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,可作为骨组织工程学研究的种子细胞。     

骨髓基质细胞体外增殖后移植修复关节软骨缺损的实验研究

目的 :用组织工程的方法将骨髓基质细胞体外培养增殖后植入软骨缺损 ,观察关节软骨缺损的修复效果。方法 :抽取兔骨髓基质细胞体外培养增殖后 ,将其与Ⅱ型胶原凝胶相结合 ,植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损中 ,对照组的缺损分别置入与髓腔血混合的Ⅱ型胶原凝胶、单纯Ⅱ型胶原凝胶或不作任何处理 ,术后 4、8、12周取材观察及组织学检查。结果 :术后 4周 ,实验组的缺损由透明样软骨样组织充填 ,术后 12周 ,软骨及软骨下骨组织基本修复 ;在对照组缺损 ,软骨下骨在术后 12周亦基本修复 ,但表层软骨主要由纤维组织修复。结论 :骨髓基质细胞来源丰富 ,采集方便 ,经体外培养增殖后 ,足量的未分化细胞与Ⅱ型胶原凝胶载体相结合 ,修复关节软骨缺损的效果较好。     

兔骨髓基质细胞促进血管生成和成骨作用

目的了解骨髓基质细胞(BMSCs)对珊瑚人工骨血管生成和成骨作用的影响。方法从兔的骨髓中分离BMSCs进行体外培养扩增后,载入珊瑚人工骨,植入新西兰白兔桡骨干中段15 mm的骨缺损内,与未植入任何填充材料和仅植入珊瑚人工骨的实验动物相比较,使用放射学、微量CT和组织形态学等方法对骨缺损内新生血管和骨组织进行定量分析。结果未植入填充材料的骨缺损全部形成典型的骨折不愈合表现;植入珊瑚骨后,骨缺损内的新骨形成增加但新生血管无明显改变,术后16周无一例完全愈合;植入BMSCs和珊瑚人工骨复合物的骨缺损内新生血管和骨组织均明显增多,术后16周2/3的骨缺损完全愈合。结论BMSCs可促进血管生成和对人工骨材料的爬行替代作用。     

人骨髓基质细胞接种珊瑚构建组织工程骨

目的：观察体外培养的人骨髓基质细胞与珊瑚复合物植入体内后的成骨能力。方法：穿刺抽吸入髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导，将其与珊瑚复合后植入裸鼠体内，以单纯珊瑚作为对照。术后4、8周取材，通过大体、组织学、扫描电镜观察植入物体内成骨情况。结果：术后4周，复合物中有少量新骨形成；术后8周，复合物中出现大量成熟骨组织。而对照组无骨组织形成。结论：人骨髓基质细胞复合珊瑚在无免疫动物体内具有成骨能力，穿刺抽吸的人骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞。     

大鼠SERTOLI细胞对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响

目的探索Sertoli细胞(SCs)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂、成骨和成神经诱导分化的影响。方法密度梯度离心法分离BMSCs,二步酶消化法分离SCs;对第3、4代BMSCs进行成脂、成骨及成神经诱导,并与SCs共培养,观察其形态学变化。结果油红O染色显示BMSCs成脂诱导后,胞浆出现折光性强的脂滴,加入SCs后,脂滴明显减少,染色不明显;茜素红S染色显示BMSCs成骨诱导后可显示钙结节,加入SCs后,钙结节更多,结节内红染更明显;成神经诱导在加入SCs前后没有明显差异。结论 SCs可促进BMSCs成骨分化,而抑制其成脂分化,对成神经分化则没有明显影响。