人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

人TRAF3IP3基因的克隆及真核表达

目的 构建人肿瘤坏死因子受体相关因子3相互作用蛋白3(TRAF3IP3)基因真核表达载体,并进行表达检测及鉴定.方法 RT-PCR扩增获得TRAF3IP3开放读码框区基因,双酶切连入真核表达载体pIRES2-EGFP,双酶切和测序鉴定阳性克隆;重组质粒磷酸钙法转染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot法鉴定TRAF3IP3基因的表达情况.结果 经限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,成功构建了TRAF3IP3真核表达质粒,荧光显微镜观察可见转染了重组质粒的HEK293细胞有绿色荧光蛋白的表达,实时定量PCR和Western blot结果证实TRAF3IP3蛋白高水平表达.结论 成功构建了pIRES-EGFP-TRAF3IP3真核表达质粒,为TRAF3IP3基因功能的研究奠定了基础.     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的 克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备.方法 按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段.该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达.结果 扩增片段长度为285 bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确.Western印迹证实pEGFP-C1-APC11在真核细胞内表达.结论 成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP-C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础.     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

血管内皮细胞黏附分子胞外区基因真核表达载体构建及表达

目的构建并表达血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)胞外区基因真核表达载体。方法从小鼠NIH/3T3细胞提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1胞外区(D1-D4结构域)cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。将VCAM-1 D1-D4目的片段插入到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1。经双酶切鉴定VCAM-1胞外区基因真核表达载体构建的成功与否。利用脂质体把pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1导入至人B淋巴性白血病细胞株(Raji)内。结果基因测序结果表明成功扩增出VCAM-1胞外区基因,双酶切鉴定表明重组的真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1构建成功。Western blot结果显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒的Raji细胞中VCAM-1高表达。细胞结合实验表明,表达的VCAM-1与前B细胞(70Z/3)表面的VLA-4特异性结合。结论 VCAM-1真核表达载体构建及表达成功,为前B细胞克隆形成机理以及为B细胞分化发育研究提供实验依据。     

HBV融合抗原真核表达载体pIRES-neo-HBAg的构建及表达

目的 构建HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,并验证其在293T细胞中的表达.方法 以含有HBV融合抗原的质粒pVAX1-HBV为模板,PCR扩增该融合基因.PCR产物经纯化后,将其克隆至载体pMD18-T中,构建pMD18-T-HBV质粒,经酶切和测序鉴定后,将其定向克隆入真核表达载体pIRES-neo,获得真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.将该重组表达质粒瞬时转染人293T细胞,采用Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术验证HBV融合抗原的表达.结果 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg,Western blot法、流式细胞术和免疫荧光细胞化学技术结果显示融合抗原能够在293T细胞中表达.结论 成功构建了HBV融合抗原真核表达质粒pIRES-neo-HBAg.     

野生型和突变型人白介素13哺乳细胞表达质粒的构建

目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。     

线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体.方法 通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增获得线粒体抗病毒信号蛋白基因的完整序列,进而纯化回收后连接到pMDTM 18-T载体上,将pcDNA6/myc-HisA载体和带有目的片段的pMDTM 18-T载体同时进行双酶切,酶切产物过夜连接转化至大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆pcDNA6/myc-HisA-MA VS扩增后,提取重组质粒;利用PCR和核酸测序验证线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体构建的正确性;应用Western blotting的方法检测融合蛋白的表达.结果 线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体构建成功,并且该载体能够在OL细胞中表达融合蛋白.结论 成功构建线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体,为进一步研究该蛋白的功能和作用机制奠定基础.     

pcDNA3.0-RKIP重组质粒构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建RKIP真核表达质粒,并检测其在PC12细胞中的表达。方法:从大鼠背根神经节细胞中提取总RNA,应用巢式PCR技术,扩增获得RK IP基因编码序列片段,克隆入真核表达载体pcDNA3.0,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以Vigofect非脂质体介导法转染至PC12细胞,通过Western blot检测RKIP蛋白的表达。结果:酶切和测序结果证明pcDNA3.0-RKIP重组质粒的DNA序列完全正确,将其转染PC12细胞后,RKIP蛋白表达明显增加。结论:pcDNA3.0-RKIP真核表达质粒构建成功,并能在PC12细胞内表达,为深入研究RKIP的神经生物学功能提供了实验基础。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

人脂联素球状结构域基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统表达人脂联素球状结构域（gAd）基因。方法以人基因组为模板,PCR法扩增人gad基因,将gAd基因与供体质粒pFastBacHTB连接,转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac。筛选转座成功的重组穿梭载体Bacmid—gAd,通过脂质体介导,转染昆虫细胞Sf9,经SDS-PAGE、免疫印迹法检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf9细胞形态变化明显,SDS-PAGE电泳结果显示,BacmidgAd组和对照组相比．在相对分子质量15000～25000之间多出一清晰的蛋白条带．免疫印迹法证实该条带能与相应的抗His标签抗体结合。结论人gAd基因成功在真核细胞中表达,为后续的实验研究奠定了基础。     

小鼠轻度病毒性心肌炎急性期心肌组织MHCⅡ类抗原的表达

为研究小鼠急性病毒性心肌炎心肌MHCⅡ类抗原的表达规律,探索急性期轻度病毒性心肌炎的发病机制,以适量柯萨奇B3病毒感染BALB／c小鼠制成小鼠病毒性心肌炎模型,对病鼠的心肌进行MHCⅡ类抗原表达强度的半定量记分（MS）与心肌病变积分（PS）无相关。实验提示,心肌MHCⅡ类抗原的异常表达是轻度病毒性心肌炎急性期的发病机制之一：自身免疫反应在病毒性心肌炎急性期与心肌病变的严重程度无相关。     

TGF—αT —Ⅱ在乳腺癌患者围手术期的表达

胰岛素样生长因子(IGF-Ⅱ)和转化生长因子(TGF-α)是具有广泛生物学活性的多肽类生长因子,但在正常组织及肿瘤组织中的表达如何,研究报道不一。本文测定了乳腺癌患者血液、尿液及肿瘤组织IGF-Ⅱ和TGF-α水平,旨在探讨其在乳腺癌患者围手术期的表达及生物学意义。1材料和方法1.1研究对象21例女性,年龄40～71岁,均系本院手术后经病理诊断证实的乳腺癌患者。其中浸润型导管癌14例,乳腺髓样癌3例,乳腺低分化腺癌2例,导管浸润癌伴腺癌2例;正常对照组:30例,为我院查体健康的女性,年龄38～55岁。1.2标本采集及检测方法采集乳腺癌患者手术前血…     

IgE低亲和力受体基因的克隆、表达及初步鉴定

目的利用基因重组的方法建立IgE低亲和力受体（FcεRⅡ）基因的原核表达系统。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞扩增FcεRⅡcDNA基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达载体FcεRⅡ-pGEX-4T-1,将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta,诱导表达FcεRⅡ蛋白,通过割胶回收纯化,并用Western blot检测FcεRⅡ的表达。结果测序表明所扩增FcεRⅡcDNA基因,与已报道的序列一致。获得的重组蛋白经Western blot鉴定可以和人IgE特异性结合。结论成功构建了FcεRⅡ-pGEX-4T-1表达载体,获得了能和人IgE特异性结合的重组蛋白,为下一步FcεRⅡ单克隆抗体的制备及应用研究打下了基础。