HIV-1母婴传播早期诊断检测方法应用

目的应用核酸扩增技术对母婴传播婴幼儿人类免疫缺陷病毒(HIV)感染进行早期诊断,为临床应用提供依据。方法对2009-2010年HIV阳性孕产妇活产的34例3~14个月龄婴幼儿收集足底干血斑样本进行HIV-1 DNA检测。随访18个月后进行血清HIV抗体检测比较。结果 34例婴幼儿中,检出HIV-1 DNA 9例,检出率26.5%。9例HIV-1 DNA阳性患儿均未使用过抗病毒治疗。18个月后随访,34例婴幼儿除1例失访,2例检出HIV-1 DNA婴儿已死亡(根据临床有机会性感染体征诊断为AIDS),7例检出HIV-1 DNA婴儿血清抗体阳性外,其他24例未检出HIV-1 DNA的婴儿其血清抗体为阴性。两种方法检测结果比较符合率为100.0%。结论核酸检测是有效的早期诊断方法,早期诊断有利于后续开展母婴阻断工作。     

获得性免疫缺陷综合征患者抗病毒治疗后耐药基因变异分析

3例人类免疫缺陷病毒（HIV）-1阳性患者。采集血浆，设计针对HIV-1全长蛋白酶基因和部分逆转录酶基因（40-250aa）引物，RT—PCR法扩增模板RNA，PCR产物序列测定后，用HIVdb软件进行HIV-1耐药突变相关位点的分析；流式细胞术检测患者外周血CD4^＋／CD8^＋T淋巴细胞数，核酸序列扩增实验（NASBA）进行外周血病毒负荷的测定。     

HIV早期检测的应用研究

目的采用抗HIV-1 p24单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂，检测HIV-1抗体阳性及其他样品，以探讨HIV早期检测的可行性。方法采用单克隆抗体固相、兔抗HIV-1 p24抗体夹心，羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果显示试剂盒HIV-1 p24抗原检出灵敏度为50pg／mL（基因工程抗原）；特异性97．13％；HIV抗体阳性血样阳性率4．1％；抗体阴性的特殊人群血样阳性率5．2％；抗体不确定血样阳性率为16．3％，明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养1d，抗原效价1：80，第3天可达1：5360。结论该间接夹心HIV-1 p24抗原检测试剂，可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究，具有灵敏度高、特异性好的特点。     

多重巢式PCR同步筛查HBV、HCV和HIV-1的方法建立

目的:探讨多重巢式聚合酶链式反应(PCR)对血液中HBV、HCV和HIV-1同步筛查的方法进行构建。方法:选取我疾控中心HIV-1、HCV以及HBV血清标本,明确HCV、HBV与HIV-1的引物探针组合。结果:将合并感染HCV和HIV 1的样本与己知HBV DNA阳性的样本混合作为合并感染三种病毒的样本,同时提取这三种病毒核酸。结论:在HBV、HCV与HIV-1同步筛查中,多重巢式PCR具有较大的潜力。     

Alu-LTR PCR检测整合型HIV-1实验方法的优化

目的对Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法进行优化。方法收集20例HIV-1感染患者及10例健康对照者的抗凝血标本,纯化CD4+T细胞并提取DNA,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,首轮PCR5′端引物来自于人类保守的Alu序列,3′端引物来自于HIV-1LTRU5区序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1LTR的序列。第二轮引物针对HIV-1LTRU3区的序列。在首轮PCR基础上,PCR产物稀释后进行第二轮PCR。结果经过优化的Alu-LTRPCR,20例HIV病人全部检测到整合的HIV-1。结论经优化后,Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法的灵敏度明显提高。     

Alu-反向PCR检测HIV-1整合位点方法的建立

目的建立Alu-反向PCR检测整合型HIV-1DNA的实验方法。方法收集18例HIV-1感染者及12例健康者的抗凝血标本,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,第一轮PCR5’端引物来自于人类保守的Alu序列,3’端引物来自于HIV-1gag序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1DNA序列。经PstⅠ酶切后进行自身片段环化,以此为模板设计针对HIV-1LTR和gag保守区域引物,进行巢式PCR。结果 16例HIV-1感染者成功扩增出目的片段,12例健康者均为阴性。结论本实验建立的检测整合型HIV-1的方法为进一步研究HIV病毒储藏库机制提供了参考。     

献血人群中HIV感染的筛查及分子流行病学分析

目的了解深圳地区献血人群中HIV感染流行情况和分子流行病学特点。方法采用ELISA方法筛查献血者抗-HIV，罗氏公司COBASAMPLICOR．血筛分析系统检测血浆标本中HIV-1 RNA，巢式聚合酶链反应（nPCK）方法对WB确认试验阳性献血者进一步检测外周血单个核细胞中HIV前病毒DNA，并对PCIL扩增产物进行测序和病毒基因亚型分析。结果共筛查1997—2004期间的献血者标本145690人份，发现抗-HIV阳性21人份（19例），阳性率为0．015％；HIV-1 RNA检测结果与WB确认试验一致，未发现血清转换窗口期感染漏检的献血者。PCR扩增出的13份HIV env部分基因测序和基因分型显示，6例与中国云南HIV-1 B^t亚型代表株接近，为B^t亚型；7例为循环重组亚型AE（CRF01-AE），与泰国的AE亚型更为接近。结论深圳地区献血者人群HIV-1流行毒株主要为Bt和CILF01-AE2个亚型，B^t亚型主要来自以往有偿卖血人员。CRF01-AE主要来自性接触传播人员。     

东莞市艾滋病病毒1型的分子流行病学研究

目的了解东莞市不同人群中艾滋病病毒(HIV)各亚型毒株的流行情况和传播规律。方法采集东莞市经蛋白印迹法确认的24名HIV感染者的外周抗凝血,分离单核细胞、提取核酸后用套式聚合酶链反应扩增HIV-1膜蛋白(env)基因C2-V3区的核酸片段,进行序列测定,鉴定病毒亚型。用威斯康星GCG软件进行共享序列、基因离散率的计算和毒株的聚类分析。结果在24份阳性标本中,有13份标本PCR扩增阳性,亚型分析结果表明东莞市存在HIV-1B和CRF01-AE两种亚型。结论HIV-1B和CRF01-AE可能是东莞市艾滋病病毒流行的主要亚型。     

液态芯片的高敏感性检测HIV-1 RNA

目的建立高敏感的液态芯片检测血液HIV-1 RNA的方法。方法抽提NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）确定HIV-1 RNA载量的患者血浆RNA,对HIV-1引物进行生物素标记,行一步法RT-PCR扩增靶HIV-1 gag区片段。PCR产物与两个交联HIV-1特异探针的微球杂交,同时对于HIV-1病毒载量在100-790拷贝/ml样本进行荧光定量PCR检测。结果对NASBA确定阳性的上海108例（载量170-3 300 000）、COBAS定量的北京86例阳性（载量477-2 040 000）以及5例NIH的HIV标准品（〈100;273;1 610;11 300;33 800）的结果进行液态芯片多区段检测HIV-1 RNA,总阳性率为96.98%（193/199）,液态芯片检测的敏感性与NASBA、COBAS方法相当（P〉0.05）,对于HIV-1 RNA载量在180-790拷贝/ml的13个样本的荧光定量PCR未检测到信号,液态芯片检测结果为阳性。结论多区段液态芯片法检测HIV-1 RNA灵敏度高、特异性强、重复性好,降低漏检率,而且具有操作简便、快速、低成本的特点,将液态芯片技术应用于血液筛查将有助于提高HIV-1阳性血液的检出率和输血的安全性。     

HIV-1 假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究

目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系 BCBL-1 细胞的感染状况.方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5'端分别引入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点.以质粒 pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体 PcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒 pVSV-GP.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的 HIV-1 基因组重组质粒 pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK 293T细胞.收获细胞进行Western blot,检测HIV-1 p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染 BCBL-1 细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中 HIV-1 p24蛋白的含量.结果:PCR分离、克隆的 VSV-GP 序列全长1 536 bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在 HIV-1 p24 蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1 假病毒感染 BCBL-1 细胞后上清可以检测到HIV-1 p24蛋白,并且测得 Luciferase 活性值较对照组显著增高(P<0.05).结论:成功包装了 HIV-1 假病毒,并且该病毒可以感染 BCBL-1细胞.     

凉山彝族自治州HIV流行毒株基因亚型分析

目的对16例来自凉山彝族自治州的HIV感染者进行亚型分析,监测该地区感染人群HIV毒株的流行情况。方法从16例HIV-1抗体阳性样本中分离外周血单核细胞（PBMC）,从PBMC中提取基因组DNA,直接进行巢式PCR扩增HIVenv基因c2～v5区及gag基因p17～p24区,对PCR产物进行核苷酸序列测定和分析,确定基因亚型。结果 16例样本全部为BC重组亚型,env基因的基因距离较gag基因远,gag基因在进化上与CRF07-BC更为接近。结论凉山彝族自治州的HIV流行毒株主要为CRF07-BC。     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。     

北京市部分男男同性恋人群中HIV-1分子流行病学研究

目的了解北京市部分男男同性恋(men who have sex with men,MSM)人群HIV-1的分子流行情况,监测该地区人群HIV毒株的最新流行情况。方法提取17例男男同性恋者HIV-1抗体阳性样本全血基因组DNA,直接进行巢式PCR扩增HIVenv基因C2-V5区及gag基因P17-P24区,对PCR产物进行核苷酸序列测定和分析,确定基因亚型。结果17例患者中,共存在CRF01-AE、B亚型和CRF07-BC3种亚型,其中CRF01-AE9例(52.94%),B亚型5例(29.41%),CRF07-BC3例(17.65%)。结论小样本量的流行病学调查显示,北京地区部分男男同性恋人群中主要存在CRF01-AE、B和CRF07-BC3种亚型;CRF01-AE已取代B亚型而成为北京市MSM人群中HIV主要流行亚型,CRF07-BC重组亚型在北京市MSM人群中增长迅速。     

沈阳市1份人类免疫缺陷病毒的基因序列分析

目的 :对 2 0 0 4年我院门诊检出的 1例艾滋病感染者体内的HIV 1病毒进行基因序列分析和亚型鉴定。方法 :从HIV 1感染者的全血标本中提取脱氧核糖核酸 (DNA)作为PCR扩增的模板 ,套式引物扩增HIV 1前病毒DNA的p17与p2 4交界部分的基因片断并进行测序。所测定序列与各亚型国际参考株及亚洲流行参考序列进行比较 ,确定被检标本的亚型 ,并进行基因序列分析。结果 :该患HIV 1病毒属于B’亚型毒株 ,经输供血途径感染。该毒株与泰国B’亚型参考株B TH 92 92TH0 14的基因距离最为接近。结论 :在沈阳市有效地控制艾滋病经输供血途径传播应引起我们高度的重视     

适用于中国HIV-1分型的gag基因引物及其应用

目的 对中国流行的主要HIV-1毒株进行遗传特征分析,确定适用于中国HIV分子流行病学调查的gag基因扩增引物.方法 从HIV序列数据库下载CRF07_BC、CRF08_BC、C亚型及M组参考毒株的gag全长序列,经序列比对后设计gag基因扩增引物;获得的基因片段采用邻接法构建系统进化树,评价不同片段用于分析和确定HIV-1亚型的可靠性,并检测部分样本以评定效果.结果 目前我国常用的gag基因306/c-gag引物扩增片段(HXB2 836～1507)构建的系统进化树中,CRF07_BC、C亚型进化簇的Bootstrap值分别为70%和59%,其可靠性较低,难以形成较为稳定的进化簇用于病毒亚型判断.而利用设计的gag基因GUX/GDX引物扩增片段(HXB2 781～1861)构建的系统进化树中,CRF07_Bc、CRF08_BC和C亚型序列能够独立成簇,其Bootstrap值分别为99%、99%和77%,具有较高的可靠性.在实际应用中,新设计的引物具有较高的扩增阳性率和测序成功率,获得序列形成B、C亚型和CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC等5个大的进化簇,其Bootstrap值均超过80%.即使仅用下游引物GDX测序获得的较短片段亦能获得较为可靠的系统进化树.结论 GUX/GDX引物扩增获得的gag基因片段可以构建较为可靠的系统进化树,用于区分和判断我国流行的主要HIV-1毒株亚型,尤其是BC重组毒株和C亚型毒株.该方法在我国HIV分子流行病学调查和研究中有广泛的应用价值.     

Hemophiliacs with HIV antibody are actively infected

Cultures of peripheral blood mononuclear cells for human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and assays for the p24 antigen were performed for a group of 75 unselected hemophiliacs to determine whether patients positive for HIV-1 antibody are actively infected rather than immunized by viral proteins in non-heat-treated factor VIII or IX concentrates. Fifty-six (75%) of the 75 hemophiliacs were antibody positive and 55 (98%) of the 56 with antibodies also had positive cultures. The one culture-negative individual had detectable HIV-1 proviral DNA sequences in three separate samples of peripheral blood mononuclear cell DNA, as detected by a polymerase chain reaction assay. Detection of serum p24 antigen and the time to development of a positive culture were significantly more frequent and shorter, respectively, in symptomatic vs asymptomatic patients. None of the 19 hemophiliacs negative for HIV-1 antibody had positive cultures, detectable p24 serum antigen, or symptoms of HIV-1 infection. Moreover, latent HIV-1 infection was not detected in 16 female sexual partners of hemophiliacs positive for HIV-1 antibody using Western blot testing, assays for p24 antigen, HIV-1 cultures, and polymerase chain reaction assays, despite repeated unprotected sexual exposure. We conclude that antibody-positive hemophiliacs have been actively infected by HIV-1 and that a long period of latent HIV-1 infection prior to overt seroconversion is unlikely.     

缺口连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA的实验研究

目的:建立缺口连接酶链反应方法检测沙眼衣原体.方法:根据编码CT主要外膜蛋白的基因(ompl)的稳定区设计2对互补的寡核苷酸探针.采用G-LCR和常规PCR扩增CT标准株DNA,并对二者检测CT的敏感性进行比较.结果:对5种CT标准株进行G-LCR扩增,均出现54bp长度的DNA片段.敏感性实验可检测出2个CT原体,而PCR可检测出20EBs.G-LCR较PCR敏感10倍;在特异性方面,不扩增肺炎衣愿体及其他细菌DNA,具有很高的特异性.结论:G-LCR用于检测沙眼衣原体特异、敏感、快速、准确,可为CT感染的临床诊断提供依据.     

伊宁市19例HIV-1感染者gag基因序列分型研究

目的：通过扩增伊宁市维吾尔族HIV-1感染者gag基因片段,确定该民族HIV-1感染者流行株的基因亚型。方法：抽提20例新疆伊宁市HIV-1感染者的血浆标本的RNA,用巢式PCR扩增gag基因片段。将所得到的序列与国际标准株进行比较,确定被检标本的亚型。结果：在20例HIV感染者的血浆标本中,共成功扩增19例gag基因片段,扩增率为95％。经BLAST初步判断和构建进化树并与国际标准株比对确认,19例感染者感染的HIV毒株序列中,发现18例为CRF07_BC亚型,1例为C亚型。19例毒株之间的平均基因距离为0．043±0．003,与3例CKF07_BC亚型国际参考株之间的平均基因距离在0．034±0．004-0．039±0．005之间。结论：新疆伊宁市HIV-1感染者以CRF07_BC亚型为主要流行株。19例序列相互之间以及与3株不同来源的国际参考毒株之间表现出高度的同源性。     

安徽阜阳既往献血人群HIV-1感染者基因变异特征的研究

目的研究安徽省阜阳市既往献血人群中HIV-1感染者体内病毒流行株的亚型及序列变异特征。方法用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）对HIV-1外膜蛋白（env）基因和核心蛋白（gag）基因进行扩增,获得244例患者的env基因V3-C3及其邻近区域序列和245例患者的gag基因区序列,应用MEGA软件进行分析,同时结合患者的疾病进展阶段进行相关性研究。结果系统进化树显示安徽省阜阳市患者体内HIV病毒的env和gag区序列属泰国B亚型;env和gag区的组内基因距离分别为9．11％和3．59％;按CD4细胞绝对计数分层,随CD4细胞绝对计数降低,env、Gag组内基因距离明显升高;随病毒载量水平增加,各组基因距离有增大的趋势,且差异均有统计学意义（P〈0．001）。env区V3环序列13份长期不进展者7份顶端四肽为GPGQ,53份缓慢进展者33份顶端四肽为GPGR,两者间差异有统计学意义（P=0．038）。结论安徽省阜阳市既往献血人群HIV-1感染者体内的病毒流行株是B′亚型。CD4和病毒载量作为疾病进程不同阶段的指标,与病毒变异有相关性,即随CD4降低、病毒载量升高病毒组内基因距离增大。HIV B′亚型V3环顶端四肽随疾病进展由GPGQ为主变为GPGR为主。     

深圳地区120株HIV-1膜区和结构蛋白区基因变异分析

目的研究深圳地区HIV-1病毒株在膜区和结构蛋白区基因变异情况,比较不同亚型毒株之间基因离散率的差异。方法收集HIV-1感染者新鲜血浆,提取血浆中HIV-1病毒株RNA,RT-PCR套式扩增env区和gag区基因,基因测序后进行序列比对和分析,构建基因进化树,计算基因离散率。结果各亚型毒株在env区相互之间基因离散率最大的是B亚型和07-BC亚型,最小的是07-BC亚型和08-BC亚型;各亚型毒株在gag区相互之间基因离散率最大的是01_AE亚型和07-BC亚型,最小的是07-BC亚型和C亚型。结论 07-BC、08-BC及C亚型在两个基因片段上基因距离均最近,说明这三个亚型可能有共同的起源。