密度梯度离心与贴壁法相结合体外分离培养兔骨髓基质干细胞：1～3代细胞生长特性

目的:采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方式,对兔骨髓基质干细胞进行体外分离、培养和扩增。方法:实验于2006-11/2007-08在广西医科大学完成。①实验方法:取6周龄大白兔8只,麻醉后切开皮肤充分暴露下肢骨,无菌条件下穿刺股骨干骺端,抽吸骨髓液约12mL,以等体积磷酸盐缓冲液稀释,注入含有等体积人淋巴细胞分离液的离心管中,离心收集中间云雾状细胞层,磷酸盐缓冲液洗涤,去除多余的脂肪细胞及组织液,加入适量的含双抗的10%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液,离心后弃上清,以1×108L-1密度接种于培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。48h后首次换液,弃去未贴壁或已死去的细胞,隔日换液。至8～12d贴壁细胞融合为单层时胰蛋白酶消化传代。②实验评估:用倒置相差显微镜观察每天细胞的生长情况。取第1～5代处于对数生长期的细胞,计算贴壁率,同时绘制细胞生长曲线。结果:①兔骨髓基质干细胞生长情况及形态学特点:原代培养8h骨髓基质干细胞开始贴壁生长,其他杂质细胞悬浮于培养基中;3d后贴壁细胞逐渐变为梭形并且增大,少数细胞呈现多角形,高倍镜下可见细胞质丰富,细胞较大,呈椭圆形,轮廓清晰,核内可见核仁存在;1周后大部分细胞贴壁延伸,体积变大,数目增多,多呈长梭形或三角形;第12天细胞呈集落生长。第1～3代兔骨髓基质干细胞体外培养生长稳定,增殖迅速,细胞形态基本相同。第4代细胞体积始增大,胞内有颗粒样物质出现。第5代细胞体积更大,细胞呈椭圆形改变,部分细胞开始脱落死亡,增殖能力较前4代明显下降。②细胞贴壁率:接种后12h第1～3代细胞贴壁率为95%,第4代细胞贴壁率为88%,至第5代细胞贴壁能力差,贴壁率仅为72%。③细胞生长曲线:第1～3代细胞生长曲线基本相同,第4,5代细胞长势均明显下降。结论:采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方式能够成功分离培养兔骨髓基质干细胞,第1～3代细胞体外培养生长稳定,贴壁率高,活性良好。     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的:以二甲基亚砜作为保护剂,采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的兔骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。方法:实验于2003-09/2005-06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只,抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞,并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞,经消化后离心重悬,用完全培养液调整细胞浓度为6×109L-1。将质量浓度为250g/L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中,混匀,二甲基亚砜的终浓度为125g/L,骨髓基质干细胞的终密度为3×109L-1,1mL/安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中;-20℃及-60℃冻存,则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中,壁厚1.5cm,扎紧密封,各置-20℃及-60℃冰箱过夜,取出后分别直接放于-20℃及-60℃冰箱保存;-196℃液氮冻存,则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后,取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d,10d,1,3,8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后,给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出,立即置37℃水浴并轻轻摇动,约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后,离心重悬,进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1×104/cm2用完全培养液再培养,观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果:实验选取3月龄新西兰大白兔5只,全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况:培养3d时,骨髓基质干细胞数量较少,散在分布,呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落,细胞变长。此后集落细胞迅速增多,逐渐汇合成片,形态为均一的长梭形,呈旋涡状排列,2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况:刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形,数小时后迅速贴壁,重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长,形态比原代培养更均一,细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较:兔骨髓基质干细胞液氮保存1年,存活率为79%;-60℃保存1,3,8个月的存活率分别为67%,38%和0%;不宜于4℃及-20℃保存。④复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况:复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异,呈长梭形生长,增殖旺盛。结论:分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强,短期保存可用-60℃冻存,长期需液氮保存,为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的影响

背景:目前用于分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠法,后两种方法可获得较为纯化的骨髓间充质干细胞,但对细胞活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性.目的:观察不同分离方法、培养条件下,兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的变化. 设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2006-01/2007-06在中国医科大学附属盛京医院感染病实验室完成.材料:日本雄性大耳白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.Mesen Cult干细胞培养基为Vancouver BC公司产品,DMEM/F12(1∶1)培养基、LG-DMEM培养基均为Hyclone公司产品.方法:无菌抽取兔髂前上棘骨髓,采取两种方法分离骨髓间充质干细胞.全骨髓贴壁分离法是将骨髓液注入等体积的Hanks液中,4 ℃ 1 000 r/min离心5 min,弃上清,用Hanks液重复洗涤.Percoll密度梯度分离法是将相当于2倍骨髓液体积的1.073 g/mL Percoll分离液加入15 mL无菌离心管内,再将抗凝的骨髓沿管壁缓慢加至分离液面上,4 ℃ 800 r/min离心 30 min,吸取分离液面上的白色云雾状单个核细胞层,用无血清L-DMEM培养液冲洗.将分离的骨髓间充质干细胞浓度调整为1×106,设立3组,分别加入Mesen Cult干细胞培养基、DMEM/F12培养基、L-DMEM培养基,各组培养基中均含有20%的胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 u/mL链霉素,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养.主要观察指标:不同分离方法、培养条件对细胞形态、生长特征、增殖的影响,细胞超微结构变化,传代后冻存复苏情况.结果:全骨髓贴壁分离法1周后可见少许贴壁细胞伸出伪足,10～12 d形成散在细胞集落,16～18 d融合成单层;Percoll密度梯度分离法培养1～2 d后可见部分细胞贴壁,5～7 d形成散在细胞集落,2周后融合成单层并铺满平底.不同培养条件下的第3代骨髓间充质干细胞,Mesen Cult组细胞增殖能力、贴壁率、BrdU标记指数均略优于DMEM/F12组、LG-DMEM组,但差异无显著性意义(F=0.179,P > 0.05;F=0.098,P > 0.05;χ2=0.39,P > 0.05).透射电镜下可见核仁,细胞器少,为低分化的幼稚细胞.复苏第9代冻存的细胞,4 h后贴壁率约60%,细胞增长活跃.结论:Percoll密度梯度法和全骨髓贴壁法分离的兔骨髓间充质干细胞,前者可获得较均匀一致的单核细胞,在细胞增殖、清除造血细胞干扰等方面明显优于后者;Mesen Cult、DMEM/F12、LG-DMEM培养液均适用于兔骨髓间充质干细胞的培养;细胞冻存复苏后生长增殖状况良好.     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的：以二甲基亚砜作为保护剂，采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的免骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。 方法：实验于2003-09／2005—06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只，抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞，并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞，经消化后离心重悬，用完全培养液调整细胞浓度为6&;#215;10^9L^-1。将质量浓度为250g／L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中，混匀，二甲基亚砜的终浓度为125g／L，骨髓基质干细胞的终密度为3&;#215;10^9 L^-1，1mL／安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中；-20℃及-60℃冻存，则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中，壁厚1．5cm，扎紧密封，各置-20℃及-60℃冰箱过夜，取出后分别直接放于-20℃及—60℃冰箱保存；-196℃液氮冻存，则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后，取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d，10d，1，3，8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后，给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后，离心重悬，进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1&;#215;10^4／cm^2用完全培养液再培养，观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果：实验选取3月龄新西兰大白兔5只，全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况：培养3d时，骨髓基质干细胞数量较少，散在分布，呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落，细胞变长。此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形，呈旋涡状排列，2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况：刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形，数小时后迅速贴壁，重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养更均一，细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较：兔骨髓基质干细胞液氮保存1年，存活率为79％；-60℃保存1，3，8个月的存活率分别为67％，38％和0％；不宜于4℃及-20℃保存。（少复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况：复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异，呈长梭形生长，增殖旺盛。 结论：分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强，短期保存可用-60℃冻存，长期需液氮保存，为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

体外培养羊骨髓来源间充质干细胞的生物学特性观察

背景:目前关于鼠、兔等小动物骨髓来源间充质干细胞的研究较多,但涉及大动物骨髓来源间充质干细胞的报道甚少.目的:体外培养羊骨髓来源间充质干细胞,并了解其生物学特性.方法:取健康10月龄中国山羊1只,麻醉后于髂后上棘穿刺抽取骨髓5mL,采用全骨髓培养法接种于无菌塑料培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基.待细胞达80%-90%融合后,胰蛋白酶消化传代.取P3代处于对数生长期的细胞予以冻存,然后进行复苏.倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,Yon Kossa's染色检测成骨诱导分化潜能.结果与结论:原代培养羊骨髓来源间充质干细胞贴壁生长,呈梭形;P3代后细胞形态基本一致,均为长梭状;冻存复苏后细胞贴壁较传代细胞稍慢,细胞形念和活性与传代细胞没有明显差别.P3-P5代细胞生长周期基本一致,接种后两三天为生长迟滞期,3 d后进入对数生长期,六七天为生长平台期,其后牛长速度减缓.羊骨髓来源间充质干细胞成骨诱导3周后,Von Kossa's矿化结节染色呈阳性.证实所培养的羊骨髓来源间充质干细胞具有较强的遗传稳定性和增殖能力,可向成骨细胞定向分化.     

贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证

背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去多分化潜能，因此必须对培养的细胞及时冻存，需要时再进行复苏。目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06／2008—06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12．5％DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4℃冰箱2h，然后移入-30℃冰箱2h，再置于厚壁塑料泡沫盒中，扎紧密封，置-80℃冰箱过夜后，取出冻存管直接放入液氮中保存，或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或80℃冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，1-2min内迅速解冻。主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长，贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后，将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养，细胞形态及生长状态与冻存前无差异，均呈长梭形均匀分布生长，细胞生长增殖旺盛。结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法町获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

改良Dexter法与IMDM培养基培养骨髓基质细胞的比较

背景:体外分离培养骨髓基质细胞,并于骨髓移植后将其注入严重联合免疫缺陷鼠体内,对于促进造血及免疫重建尤为必要.目的:比较骨髓基质细胞在不同培养条件下的生长状况,寻找一种体外分离培养扩增骨髓基质细胞简单而实用的方法.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2006-07/2007-01在太原市中心医院皮肤科实验室完成.材料:人骨髓取自太原市中心医院血液科经筛选的正常骨髓(取材均经患者同意).方法:分离人骨髓单个核细胞,对照组采用改良Dexter法培养:将骨髓单个核细胞用5×10-7mol/L氢化可的松的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×109L-1,以每孔1 mL接种于24孔培养板,培养2 d后全量换液,去除非贴壁细胞,之后每3 d半量换液1次.细胞生长至半融合状态时传代,传两三代后用胰酶消化,收集细胞,液氮冷冻保存.实验组用IMDM培养基培养:用不含氢化町的松的IMDM培养基培养,其余成分及培养条件均与对照组相同.2 d后全量换液,去除非贴壁细胞,之后每4天半量换液1次.传代及收集方法同对照组.主要观察指标:通过倒置显微镜观察细胞贴壁情况、形态变化及增殖状态,MTT比色法检测细胞增殖活性.结果:倒置显微镜下,两组培养细胞在接种24 h后细胞大量贴壁并伸展开,随着培养时间延长,贴壁细胞数量增多,14 d左右细胞铺满板底达融合状态.传代细胞经消化后变形,24 h后恢复原来形态,并贴壁增殖,形态和原代细胞相似,4.0～5.0d后呈融合状态.两种方法培养的骨髓基质细胞增殖活性差异无显著性意义(P>0.05).结论:改良Dexter法及IMDM培养基培养均可使骨髓基质细胞在短期内贴壁及增殖.IMDM培养基由于不需加氢化可的松,故比改良Dexter法更易于操作.     

不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较

目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件。方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行。①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓。③贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4d换液1次。④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073。将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同。⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征。进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据。两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。结果:18只大鼠均进入结果分析。①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。     

贴壁法体外培养大鼠骨髓间质干细胞的生物学特点

目的:观察大鼠骨髓间质干细胞在体外的提取、分离、培养和传代的特征,为进一步的研究工作提供实验基础。方法:实验于2004-06/12在上海第二医科大学附属仁济医院神经病学实验室完成。选取幼年雄性SD大鼠,处死后分离骨髓,采用贴壁法在体外培养、传代、扩增、纯化其骨髓间质干细胞,分别观察原代和传代后第2,4,6,8代的细胞生长情况,并绘制生长曲线和贴壁率曲线。生长曲线:以平均每孔的细胞数(千个)为纵坐标,天数(d)为横坐标;贴壁率曲线:以贴壁率(%)为纵坐标,时间(h)为横坐标。贴壁率又称接种存活率:贴壁率(%)=贴壁细胞数/接种的细胞总数×100%。结果:①骨髓细胞刚接种时呈圆型,24h后可见细胞贴壁,贴壁细胞以单核细胞为主,在72h后逐渐转变为多种形态的细胞。②大鼠骨髓间质干细胞原代细胞第1周生长速度较慢,贴壁时间长,而1周后生长加快;生长曲线及贴壁率曲线显示,传代后7代以内细胞生长速度、贴壁率基本相同;而第8代以后生长速度明显变慢,贴壁率也下降。结论:骨髓间质干细胞有一定的增殖能力,但其增殖不是无限的,为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和研究应用打下基础。     

密度梯度离心结合贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:研究骨髓间充质干细胞的培养方法,以获取大量高纯度的骨髓间充质干细胞,对应用组织工程技术重建眼部组织治疗眼部疾病具有重要意义。目的:应用密度梯度离心结合贴壁法进行成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养,观察其生长特性及大量繁殖的可能性。设计:完全随机分组设计/重复测量实验。单位:中山大学中山眼科中心病理科实验室。材料:选用6周龄SD大鼠4只,雌雄不限,清洁级2级,体质量约250g/只,由中山大学动物中心提供,许可证号码SCSK(粤2004/0011)。DMEM/F12培养基(美国GIBCo公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)、胰蛋白酶、依地酸二钠、淋巴细胞分离液。纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31单克隆抗体,免疫组化二步法试剂盒(北京中杉生物技术公司)。方法:实验于2005-09/2006-01在中山大学中山眼科中心病理科实验室完成。①取SD大鼠,断颈处死后于750g/L酒精浸泡10min。无菌条件下,分离并暴露骨髓腔,用注射器吸入应用液直接插入股骨腔,用含肝素的培养液将骨髓腔里的细胞冲洗出来作为细胞混悬液,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,观察活体细胞生长情况。②将第2代细胞接种于预置在培养板内的无菌盖玻片上,当细胞基本融合时,取出作原位甲醇固定10min,苏木精-伊红染色。原位丙酮固定10min,按二步法作免疫组织化学纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31反应,3,3’-二氨基联苯胺显色,最后将盖玻片反扣在载玻片上,封固、观察。③将细胞按4.25×107L-1的浓度接种于96孔板中,每孔200μL,置培养箱中,分别于接种后1,2,3,4,5,6d各于两排孔中加入20μL/孔四甲基偶氮唑盐,继续培养4h后吸去上清液,每孔加200μL二甲基亚砜,振荡5min后,于570nm波长测吸光度值,绘制细胞生长曲线。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞活体培养观察结果。②2代细胞免疫组织化学染色观察结果。③接种后1,2,3,4,5,6d细胞生长曲线。结果:①刚接种入培养板的大鼠骨髓间充质干细胞于倒置显微镜下可见呈大小较一致的圆形,胞膜清晰,胞体透亮。第2天可见细胞已开始贴壁,3d后多数细胞伸出伪足,变成多角形、星形或不规则形。4d后细胞开始分裂繁殖,约12d细胞便基本单层融合,呈漩涡状排列。②对分离后所获得的细胞进行免疫组化染色,细胞CD44、纤维连接蛋白均阳性,CD34、CD31均阴性。③大鼠骨髓干细胞传代后第2天细胞数量就开始大量增加,至第5天数量达到顶点,细胞融合,生长达到平台期。结论:采用密度梯度离心结合贴壁培养法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,是实用、便捷和可行的方法。并且在体外培养条件下能大量增殖,为应用组织工程技术治疗眼部疾病提供种子细胞。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景:相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低.目的:通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成.材料:健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意.方法:无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法(1500 r/min离心15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5 μg,L GM-CSF、15 μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3 d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24 h换液1次.当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型.结果:24 h后可见有少量细胞贴壁,48 h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%～90%呈现融合.第2代细胞接种后12 h开始贴壁,10 d即可达80%～90%融合.流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34.结论:实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原.     

人脐血血清对人骨髓基质细胞增殖的实验研究

目的　探究人脐血血清对人骨髓基质细胞增殖的作用。方法　无菌条件下抽取新鲜脐血 ,经肝素抗凝、离心分离血清、灭活补体、微孔滤膜过滤制备人脐血血清 ,细胞按照一定浓度接种于DMEM / 2 0 %人脐血血清培养基 ,定期观察细胞生长并更换培养基。结果　细胞接种 2 4h后有少量梭形细胞贴壁 ,2周时细胞基本长满瓶底 ,细胞呈漩涡状排列。结论　在体外人骨髓基质细胞可在含人脐血血清的DMEM中增殖     

成人和胎儿骨髓间充质干细胞的比较研究

目的 比较成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSC）的表型和生物学性状差异，为临床选择使用MSC提供实验依据。方法 取正常人和胎儿骨髓单个核细胞，在SF培养基中进行MSC培养，测定生长曲线。电镜观察MSC形态，利用流式细胞仪进行SMC表型测定和细胞周期分析；SA方法测定Ⅰ，Ⅲ型胶原和vWF因子表达。通过碱性磷酸酶染色，苏丹黑染色及骨钙蛋白和脂蛋白酯酶mRNA的表达等来检测细胞向成骨，成脂肪细胞分化情况。结果 从成人和胎儿骨髓中可培养出MSC，并保持多向分化潜能。两者在细胞形态，生长特性，表面抗原表达等方面是相似的。胎儿骨髓MSC的扩增潜力及多向分化能力明显强于成人MSC。成人骨髓MSC的粘附功能则强于胎儿。结论 从成人及胎儿骨髓中可分离培养出MSC，在体外有效扩增且保持其低分化状态和多向分化能力。胎儿MSC较成人MSC更原始，具有更大的多向分化和体外扩增潜能，可作为组织工程的种子细胞；而成人MSC支持造血，促进造血功能恢复和重建造血的功能则强于胎儿，具有更广泛的临床移植应用前景。     

猪骨髓间质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定

目的：建立猪骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离培养和鉴定的方法，探讨体外培养的间充质干细胞的一些生物学特点，为利用猪的实验研究提供实验基础。方法：猪的髂嵴穿刺吸取骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后形成单层贴壁的成纤维样的细胞。检测细胞周期，多向诱导分化鉴定分离的细胞。结果：体外培养的原代MSCs12～14d达到融合，传代后仍具有分化成骨的能力，细胞周期显示有80％的细胞处于GO／G1期。结论：体外培养猪的MSCs具有分化成骨的潜能，生长稳定，传代后仍保持未分化状态．猪骨髓间充质干细胞分离培养体系的建立为基础研究和组织工程提供了一个有价值的动物模型。     

BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性.目的:以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成.材料:4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供.方法:密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增.取5×1010L-1个骨髓间充质干细胞接种于25 mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎生血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导.取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10 μmol/L BrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率.结果:分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代争明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍末见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Von kossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%.结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BndU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法.     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向诱导分化及免疫组化鉴定

目的建立体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,体外诱导其向神经元样细胞方向分化。方法应用细胞培养技术从大鼠股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养,以形态学方法鉴定间充质干细胞,在倒置显微镜下观察细胞的形态特征,利用含10 ng/ml bFGF的LG-DMEM及含200μmol/L BHA、2%DMSO的无血清DMEM诱导其向神经元样细胞分化,并通过免疫组化方法鉴定。结果经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,类似于成纤维细胞;成神经元诱导24 h后,多数MSCs变为典型的神经元样细胞,胞体向胞核收缩并有较多的长突起,免疫组化显示神经元特异性标志NSE、神经巢蛋白Nestin染色阳性。结论体外成功的进行了MSCs原代及传代培养,细胞生长稳定、增殖迅速并可多次传代,经诱导后具有向神经元样细胞分化潜能。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞形态学的实验研究

目的：慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞形态学实验观察。方法：将慢性粒细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞，自骨髓经密度梯度离心分离、纯化和培养，观察原代和传代细胞的细胞形态。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞最佳的的贴壁时间为3d，生长性状不一，散在圆形细胞群、树枝状细胞群、飞燕状细胞群、火焰状细胞群。结论：体外非诱导培养的骨髓间充质干细胞方法可能为临床治疗慢性粒细胞性白血病患者进行异基因骨髓移植后抑制移植物抗宿主病反应提供物质基础。     

体外分离培养小鼠肺间充质干细胞的生物学特性及其对肺损伤干预效果

背景:肺脏含有多种内源性干细胞,分别为来源于内胚层或中胚层的前体细胞,阐明肺组织间充质干细胞的特性有助于了解其在肺损伤中的生物学作用。目的:观察体外分离培养的小鼠肺组织间充质干细胞生长状态、表面标志、分化功能等生物学特性,探讨其对肺损伤鼠的干预效果。设计、时间及地点:细胞学体外观察与随机对照动物体内实验,于2005-10/2007-08在解放军军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学实验室完成。材料:清洁级三四周龄C57BL/6雄鼠,用于分离培养肺组织间充质干细胞;清洁级6~8周龄C57BL/6雌鼠20只,分为细胞移植组、模型对照组,10只/组。方法:分离雄鼠肺组织,Ⅱ型胶原酶消化后,Ficoll法离心,收集界面层细胞,贴壁法分离培养肺组织间充质干细胞,当细胞接近70%~80%汇合时消化传代。细胞移植组、模型对照组小鼠按20mg/kg腔注射马利兰抑制骨髓干细胞的迁移后,均建立博莱霉素诱导的肺纤维化模型,造模后细胞移植组尾静脉注入5×105个肺间充质干细胞,模型对照组气管内注射100μLPBS。14d后取材,制备肺组织石蜡切片。主要观察指标:体外培养的肺组织间充质干细胞的生长状态、免疫表型、基因表达、分化潜能、集落形成能力以及静脉移植减轻肺损伤效果。结果:小鼠肺组织来源的间充质干细胞为成纤维样细胞,在体外能够长期培养和快速扩增;其细胞免疫表型为Sca-1 ,CD44 ,CD29 ,CD105 ,CD54 ,CD34-,CD45-,CD11b-,c-kit-,CD31-;不表达肺泡上皮细胞标志表面活性蛋白C、水通道蛋白5、clara细胞分泌蛋白,胚胎干细胞标志Oct-4和Nanog基因在培养扩增的细胞中持续表达;能够被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和表达表面活性蛋白C的肺泡2型上皮样细胞;集落形成率约3%;经静脉输注后,细胞移植组肺损伤和纤维化程度较模型对照组减轻,Masson染色显示只有少量血管周围呈阳性,且经骨髓抑制处理后已接近正常肺组织。结论:体外培养的小鼠肺间充质干细胞能够快速扩增,可向脂肪细胞、成骨细胞和肺泡上皮细胞方向分化;静脉移植后有助于肺组织修复、减轻肺损伤和纤维化程度,且骨髓抑制不影响肺间充质干细胞的保护作用。