肺癌患者外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

目的 探索体外扩增成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，并进一步鉴定Dc的形态及表型，为开展肿瘤临床生物治疗奠定基础。方法 取肺癌患者外周血，经淋巴细胞分离液分离得到DC前体细胞，加入生长因子DCGF诱导DC生成，并加入自体肿瘤相关抗原刺激。收集细胞用透射电镜观察，并用流式细胞仪测定细胞表型。结果 应用该法扩增细胞可以得到大量成熟DC。电镜观察DC具有典型的形态。流式细胞仪细胞表型测定CD80为81．8％，HLA—DR为98．3％，CD86为69．8%，CDla为19．7％，CD14为66．9．1％，CD80和HLA-DR较未成熟DC的表达明显增加。结论 肺癌患者外周血体外培养可成功地获得成熟的DC，进一步为肿瘤临床生物治疗奠定了基础。     

人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

肿瘤患者自体血浆诱导树突状细胞的实验研究

目的探讨以实体瘤患者自体血浆替代胎牛血清诱导外周血单核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)的可行性,为临床应用提供实验依据。方法以血细胞分离机分离经动员的实体瘤患者外周血单核细胞(PBMC),在自体血浆(AP)、胎牛血清(FCS)等培养条件下,加入rhGM-CSF、rhIL-4和nrhTNF-α培养7~9 d诱导成为树突状细胞,进行细胞形态、表型及刺激T细胞增殖能力分析。结果在不同血清条件下,PBMC经诱导后均出现典型的树突状细胞形态和超微结构;但流式细胞术分析显示,以自体血浆培养的DC共刺激分子CD86为(74.09±0.92)%,MHCⅡ类分子HLA-DR为(91.73±1.96)%,显著高于FCS培养的DC;并且同种混合淋巴细胞反应结果显示AP-DC具有更高效的刺激T细胞活化增殖的能力。结论以AP代替FCS,实体瘤患者PBMC可被诱导为表型更成熟的DC;该方法既可去除异种蛋白干扰,又利于DC成熟,可作为临床应用DC的培养途径。     

人脐血来源的树突状细胞的体外培养扩增

目的　研究人脐血来源的树突状细胞 (DCs)体外培养扩增 ,并检测其功能。方法　应用Ficoll Hypaque离心获得界面细胞 ,贴壁培养 2h ,获得单个核细胞 ,体外以重组hGM CSF( 5 0ng/ml) hIL 4( 10ng/ml) hTNF α( 5 0ng/ml)诱导培养 14天。在DCs发育过程中 ,在光镜下观察其生长情况 ,应用流式细胞仪检测DCs表型。采用MTT法检测DCs活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤性。结果　第 6天体外培养的DCs由贴壁状态变为悬浮毛刺状细胞 ,随着培养时间的延长 ,此类细胞数量增多 ,第 12天为形态不规则的毛刺状 ,为典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明 ,成熟DCs高水平地表达HLA DR、CD 80、CD83、CD 1a、CD 11c、CD12 3。被激活的T细胞对 2种来源于不同组织的肿瘤细胞均产生了明显的杀伤性。结论　人脐血经rhGM CSF rhIL 4 hTNF α体外诱导培养 ,能诱导出DCs。     

宫颈癌患者外周血树突状细胞的体外扩增和鉴定

 目的 探索体外扩增宫颈癌患者外周血来源的成熟树突状细胞(denelritic cell，DC)的方法，并鉴定DC的形态、结构、表型及生物学活性。方法 淋巴细胞分离液分离宫颈癌患者外周血，得到DC前体细胞(PBMC)，以(3M-CSF、IL-4、TNF-α诱导培养。用光镜和透射电镜观察形态结构，流式细胞仪检测细胞表面特异性分子，MTT法测定DC刺激T细胞增殖的活性。结果 联合应用细胞因子可诱导扩增出源自宫颈癌患者外周血的成熟DC，具有典型形态特征，较高表达HLA-DR、CD1a、CD80，能强烈激发同种异体T细胞增殖反应。结论 宫颈癌患者外周血体外培养可成功获得成熟的DC，为开展宫颈癌临床免疫治疗奠定了基础。     

人外周血树突状细胞诱导及免疫学特性研究

[目的]从人外周血分离、纯化、扩增树突状细胞(DC),并对其形态学和免疫学特性进行初步探讨.[方法]从人外周血分离DC前体细胞(主要为CD14 细胞)用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增成熟DC.观察DC形态、分析DC表型、核型及检测DC激发同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]分离的DC前体经rhGM-CSF和rhIL-4共同培养1周后,可获得大量成熟DC,扩增了24.5倍,纯度达90%以上.DC高表达分化抗原CD86、CD40、HLA-DR、CD83、CDIa,能强烈激活同种异体T淋巴细胞增殖.[结论]人外周血CD14 细胞经体外诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,从而为进一步开展DC的基础研究和临床应用打下基础.     

树突状细胞体外诱导分化扩增方法的研究进展

树突状细胞(dendritic cells,DCs)是一种重要的免疫辅佐细胞,是体内最广泛的专职抗原递呈细胞(profession-alantigen presenting cells),具有强大的激活静息T细胞,激发初次免疫应答的独特功效,在肿瘤免疫治疗中,具有潜在的应用价值.     

乳腺癌患者(外周血中)激活的T/B淋巴细胞表达树突状细胞分子CD1a和CD83增加

目的 研究CD1a和CD83分子是否特异性地表达在乳腺癌患者外周血中培养的树突状细胞上。方法 采用密度梯度离心的方法,分离32例乳腺癌患者外周血中的单个核细胞,在6孔培养板上(106/ml,2ml/孔),用含10％热灭火的小牛血清和GM-CSF、IL-4、TNF-α细胞因子的RPMI1640培养基培养。(贴壁)2小时后,轻轻吸去非贴壁细胞并加入新鲜培养基。用标有荧光素的单抗标记培养细胞,在流式细胞仪上分析培养细胞,本研究中所用的单抗有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD1a、CD3、CD19、CD40、CD80和藻红朊(PE)标记的CD3、CD19、CD83、CD86、MHCⅡ。在激光共聚焦显微镜下拍摄标记有荧光素的细胞。结果 该细胞表达特征性分子CD1a、CD4O、CD80、CD83、CD86,CD1a、CD83在CD3+T、CD19+B淋巴细胞上也表达,在激活的淋巴细胞上表达水平高于未激活的淋巴细胞,而且B淋巴细胞上的表达水平高于T淋巴细胞。结论 CD1a和CD83分子并非DC特有的标记,目前鉴定DC仍然要靠细胞形态、细胞表达CD1a、CD83以及共刺激分子等综合因素来确定DC。     

人外周血树突状细胞的诱导培养及冻存

目的：探讨人外周血树突状细胞（DC）的诱导培养及冻存方法和意义。方法：通过树突状细胞的分离和培养、抗原标本前处理、抗原的装载、实验分组、细胞冻存等，摸索出树突状细胞诱导扩增以及促进成熟的优化实验方案。结果：外周血单个核细胞可作为DC的来源，GM—CSF和IL-4可诱导其前体细胞向DC分化，添加促成熟细胞因子可以让细胞维持细胞生物活性。结论：人外周血DC细胞的诱导培养及冻存具有重要意义。冷冻DC细胞保持了它的特性，但会因冻融过程生物特性有所减低，为此在应用冻存DC细胞时应考虑增加输入细胞量。     

树突状细胞提呈凋亡癌细胞抗原的实验研究

目的：建立从人外周血诱导扩增树突状细胞（ＤＣ）及吞噬凋亡小体负载抗原。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞,加入５０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ－ＣＳＦ,１０００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ－４,隔天一次,共４次,培养第三天,加入γ射线照射过的胆管癌细胞,再继续体外培养一周后,用树突细胞富集柱收集ＤＣ。结果：见ＤＣ高表达共刺激分子Ｂ７和ＣＤ１ａ,表面具有典型不规划突起,ＤＣ还可捕捉凋亡小体、吞噬凋亡小体。负载抗原     

无血清专用培养基体外快速培养临床级树突状细胞的实验探讨

目的：探讨采用无血清专用培养基从肺癌患者外周血单核细胞快速培养树突状细胞（DCs）的方法。方法：将10例肺癌患者外周血单核细胞同时采用含人AB型血清培养基和无血清DCs专用培养基（DC Mediurn）培养．5例于第7天加入促成熟细胞因子组合，第9～10天收获成熟DCs，另5例于第5天加入促成熟细胞因子组合．且TNF-α剂量加大5倍，第7天收获成熟DCs。结果：DC Medium培养的DCs形态变化快。细胞出现突起的时间早：9～10天收获的两种培养基培养的DCs性能无差异；7天收获的DCs中，DC Medium培养的DCs得率和纯度、共刺激分子表达水平、刺激T细胞增殖能力均优于含血清培养基。结论：无血清DCs专用培养基可以在体外快速培养临床级DCs．为肿瘤免疫治疗奠定基础。     

钙载体A_(23187)快速诱导人外周血单核细胞成树突状细胞

 目的　探讨钙载体 (calciumionophore ,CI)A2 3 187对正常人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)形态、表面分子表达及免疫功能的影响。方法　分离健康献血者外周血单核细胞 ,分别加入 :重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0ng/ml、rhGM CSF 10 0ng/ml +IL 4 5 0ng/ml、rhGM CSF +A2 3 187(钙载体 ,CI)各 10 0ng/ml。体外培养 4 0h后 ,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志、MTT比色法检测上述细胞对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果　外周血单核细胞在GM CSF +A2 3 187各 10 0ng/ml的条件下培养 4 0h ,就可看到典型的DC形态 ,其表面单核细胞的特征性标志CD14分子表达减少 ,HLA DR、CD80、CD86及CD83分子的表达均明显增高 ,且具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论　外周血单核细胞在钙载体A2 3 187及GM CSF的共同作用下 ,4 0h就能获得成熟的DC     

人外周血单核细胞来源的DC体外分化成熟影响因素的研究

目的： 探讨不同因素对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)体外分化成熟的影响。方法：通过流式细胞仪表型分析、混合淋巴细胞反应、抗原摄取能力检测、DC对T细胞的趋化能力及对IL10的拮抗效应的测定，研究了TNFα，FL，sCD40L，CD40mAb，gp130，IL10等不同因素对DC的体外分化成熟及功能的影响。结果：CD40信号和TNFα都可以有效地使DC上调表达共刺激分子CD80，CD86并进而促进DC激发T细胞的增殖和活化及对T淋巴细胞的趋化作用，但在体外培养体系中，sCD40L能有效地拮抗IL10的抑制效应，而TNFα则明显不如sCD40L有效；激发型gp130单克隆抗体和人重组FL可以显著地促进DC的体外扩增，但是无明显地促进DC分化成熟和促进DC激发T细胞的功能。结论：CD40和TNFα都具有促进DC分化、成熟的能力，但CD40的作用明显优于TNFα。     

造血干细胞诱导树突状细胞的临床应用

目的:探讨回输自动员人外周造血干细胞(PBSC)体外诱导树突状细胞(DCs)治疗乳腺癌患者的可行性.方法:采用CS-3000血细胞分离系统分离9例粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预动员乳腺癌患者PBSC,在体外经rhGM-CSF、rhIL-4诱导和自体肿瘤细胞提取物刺激后成为成熟DCs,收集并自体回输.用MTT法测定DCs在体内外激活细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性.结果:9例患者平均采集1.02×109PBSC,培养后平均收获2.3×108DCs,CD83表达率平均为68.7%.收获DCs的数量是等量未动员全血的57.5倍.在体外自体肿瘤抗原致敏的DCs激活CTL对自体原代培养的肿瘤细胞具有显著的杀伤活性.DC瘤苗自体回输除轻微发烧外,无任何其它不良反应,回输后患者PBMC对自体肿瘤细胞的杀伤活性提高20倍.结论:用血细胞分离机分离G-CSF动员肿瘤患者PBSC,在体外诱导制备自体DC瘤苗,回输治疗可提高对自体肿瘤细胞的杀伤活性,而且安全可靠,无明显不良反应.     

体外培养DC-CIK细胞杀伤白血病细胞实验研究

目的:未缓解的急性白血病患者的外周血中存在一定比例的白血病细胞,能否诱导CIK细胞的增殖用于复发难治白血病的挽救治疗值得探讨。体外诱导培养缓解期及未缓解期急性白血病患者来源的DC-CIK细胞,比较其增殖能力,免疫表型及杀瘤活性的变化。方法:提取复发难治白血病患者和缓解期患者的研究对象的外周血单个核细胞,按常规方法诱导产生DC-CIK细胞,在培养过程中计算细胞增殖倍数,用流式细胞仪检测CD3CD8、CD3CD56双阳性率,并在细胞增殖期检测比较其对K562细胞及患者单个核细胞的杀伤活性。结果:缓解组和未缓解组来源的DC-CIK细胞均不断快速增殖,培养第15天时,缓解组CD3₊CD8₊和CD3₊CD56₊细胞分别占(87.5EeEe1.29)%,(63.8EeEe1.98)%,未缓解组分别占(88.6EeEe3.4)%,(66.8EeEe4.1)%,此时应用CCK-8法测得在效靶比为20:1时,缓解组对K562细胞的杀伤率为(42.64EeEe3.25)%,未缓解组为(57.49EeEe2.87)%;相同效靶比下,未缓解组对患者的单个核细胞的杀伤率为(67.29EeEe7.95)%。结论:应用未缓解患者的外周血单个核细胞,同样可以培养出DC-CIK细胞,具有与缓解组来源的DC-CIK细胞一致的高增殖活性和高CD3₊CD8₊、CD3₊CD56₊表达,一样对K562细胞杀伤活性较强,并对患者单个核细胞具有特异杀伤活性,未缓解患者来源的CIK细胞中未检测到白血病细胞残留,可以应用于难治白血病的挽救治疗。     

藤黄酸对肿瘤细胞诱导分化作用的探讨

目的 观察藤黄酸对肿瘤细胞的诱导分化作用。方法 从增殖能力。细胞形态和功能变化3个方面评价藤黄酸对肿瘤细胞的诱导分化作用。结果 藤黄酸可提高K562细胞的Hb含量，降低B16细胞黑色素含量，抑制Bel7402细胞增殖并在形态上有趋向分化的改变。结论 实验显示藤黄酸有诱导肿瘤细胞分化的作用。