人骨髓间充质干细胞的体外培养及诱导分化

目的 建立一株能在体外长期培养并具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞(HBMSC)。方法 利用差异贴壁法从人肋骨中分离纯化HBMSC,在体外通过地塞米松、胰岛素诱导分化为脂肪细胞,用VitC、β-磷酸甘油、地塞米松诱导下可分化成骨细胞,裸鼠体内分化为软骨样细胞及成骨样组织,采用流式细胞仪检测细胞表面CD31、CD34、CD45、CD9、CD90、CD105和CD106。以2.5×10~7细胞接种于裸鼠皮下进行致瘤实验,用DY-NAL REU-SSO反向杂交法检测HLA。结果 细胞已连续培养超过30代仍能稳定生长,细胞表面特性为CD105、CD106阳性,而CD31、CD34、CD45、CD9、CD90为阴性。在体外能诱导成脂肪细胞、成骨细胞。无致瘤性,在裸鼠体内能形成软骨细胞及骨样组织。结论 培养了一株能在体外长期培养及具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞。     

阿米福汀在非霍奇金淋巴瘤患者骨髓间充质干细胞体外化疗损伤中的保护作用

目的研究阿米福汀（WR-2721）在保护非霍奇金淋巴瘤（NHL）来源的骨髓间充质干细胞（MSC）免受化疗药物依托泊甙（VP-16）体外损伤中的作用,为临床细胞移植治疗提供依据。方法获取NHL患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增,后按处理因素分为空白对照组（A）、WR-2721组（B）、WR-2721＋VP-16组（C）和VP-16组（D）,分别计数细胞绘制生长曲线,流式细胞仪检测其免疫表型及凋亡,甲基纤维素半固体培养、MSC作为滋养层检测其支持造血能力,油红O染色和Von Kossa染色检测MSC向脂肪和骨的分化。结果各组因素对MSC免疫表型无影响。（B）组MSC的增殖、凋亡和支持造血能力较空白对照组差异无统计学意义（均P〉0．05）;（C）组MSC的增殖和凋亡较（D）组差异有统计学意义（均P〈0．05）,其支持造血能力均明显高于（D）组（P〈0．05）。各组MSC均能被诱导分化为骨和脂肪。结论WR-2721能显著降低MSC遭受化疗药物VP-16的体外损伤,其对NHL骨髓来源MSC体外的增殖、凋亡、免疫表型、造血支持能力和分化能力无明显影响。     

慢性粒细胞性白血病患者间充质干细胞的分离、纯化及向神经元样细胞分化的研究

目的研究慢性粒细胞性白血病（CML）骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、纯化、扩增以及在体外向神经元样细胞定向分化的能力。方法获取CML患者的骨髓MSCs，采用低血清培养液培养，瑞士染色观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型和细胞周期；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测CML特异性表达的bcr／abl基因；分析骨髓MSCs染色体核型。全反式维甲酸（ATRA）诱导MSCs在体外分化为神经元样细胞，倒置相差显微镜观察神经元样细胞的形态，免疫组织化学染色法和Western blot法检测神经丝蛋白（NF）和神经元烯醇化酶（NSE）的表达。结果CML来源的骨髓MSCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；表达相关抗原CD29、CD44、CD105，不表达CD31、CD13、CD34、CD45、HLA—DR；不表达bcr／abl融合基因，且具有正常的核型；不同扩增代数的MSCs在诱导剂的作用下呈现典型的神经元样细胞形态，NF、NSE呈阳性反应。结论CML患者骨髓中可以分离培养MSCs，它具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性和定向分化为神经元样细胞的能力，是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行分离培养与鉴定,并使其诱导分化为神经细胞.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养BMSCs,观察细胞形态变化及生长、增殖情况;对细胞进行表面标志物CD14、CD34、CD44、CD29免疫荧光染色及向骨、软骨和脂肪分化能力的鉴定;选用第3代细胞,经全反式维甲酸(retinoic acid,RA)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophy factor,BDNF)联合诱导后,免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物Nestin及神经细胞标记物NSE的表达情况.结果 体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,CD44和CD29的阳性率在90%以上,具有明显的向骨、软骨和脂肪分化的能力,经诱导后可分化为神经细胞.结论 成功建立了体外分离扩增BMSCs的培养体系,所获得的细胞纯度高、生物学特征稳定,并可在体外诱导分化为神经细胞,从而为下一步细胞移植治疗脑缺血动物模型提供种子细胞.     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

睾酮定向诱导MSC分化的实验研究

目的：激素体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，睾酮定向诱导MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。睾酮诱导6h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外经睾酮诱导分化为神经元样细胞。     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

不同组织源性细胞作为大动物骨缺损修复研究用骨组织工程种子细胞的增殖及成骨分化比较

【目的】比较源自同一大动物个体不同组织的成骨性种子细胞的体外增殖及成骨分化能力,寻找和筛选更符合大动物骨缺损修复研究要求的种子细胞来源和分离方法。【方法】选用中国青山羊模型,参照常规方法,分离骨膜、骨髓、脂肪源性细胞进行体外培养,倒置显微镜观察,记录原代细胞的汇合生长时间;细胞传代后成骨诱导培养21 d,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活力;细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性及细胞分泌骨桥蛋白测定、钙结节茜素红S染色检测细胞的成骨分化能力。【结果】骨膜、脂肪、骨髓源性原代细胞汇合生长时间分别为14、11和7 d;传代后MTT法检测显示细胞增殖能力从强到弱依次为骨髓、脂肪、骨膜源性细胞。细胞内ALP活性、细胞分泌骨桥蛋白及钙结节染色显示细胞进入成骨分化的先后顺序依次为骨膜、骨髓、脂肪源性细胞。【结论】在体外培养的各个阶段,来自同一大动物个体的不同组织源性细胞的增殖及成骨分化能力存在明显差异,其中骨髓及脂肪源性细胞更适于大动物骨缺损研究的需要。     

间充质干细胞成血管因子受体表达特征及其意义

目的:探讨间充质干细胞成血管因子受体表达特征及其意义。方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养骨髓源间充质干细胞(MSC),通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞分析其表面标记(CD34、CD90、CD29)等鉴定MSC特征;以P1-P17MSC为实验材料,利用RT-PCR的方法检测PDGFR、VEGFR和NRP1的表达。利用Transwell体外迁移体系初步探索VEGF在MSC迁移中的作用,同时利用MTT法评价VEGF对MSC增值的作用。结果:培养的MSC呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;强表达PDGFR-β和NRP1、不表达VEGFR(Flk1和Flt1)和PDGFR-α,VEGF促进了MSC的增殖和迁移。结论:VEGF可能通过PDGFR-NRP1促进了MSC的增值和迁移。     

骨髓间充质干细胞培养及向神经细胞诱导分化的实验研究

目的：体外培养骨髓间充质干细胞(BM—MSC)，诱导BM—MSC向神经细胞分化。方法：采用DMEM培养液加胎牛血清(DMEM／FBS)或无血清培养基体外培养人BM—MSC，测定细胞倍增时间；免疫组织化学法分析BM—MSC的表面标记；纤维母细胞集落形成(CFU—F)试验检测BM—MSC增殖能力；应用二甲基亚砜／羟丁苯甲酯(DMS0／BHA)化学因子诱导BM—MSC向神经细胞分化。结果：BM—MSC为单层贴壁生长，呈现规则的集束辐射状排列。在对数生长期，细胞倍增时间约为46h。CFU—F试验表明，体外培养的MSC的集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)的15000倍以上。免疫组化分析表明，BM—MSC为CDl3和CDl05阳性，CD34阴性。DMS0／BHA化学因子能诱导BM—MSC分化为神经细胞，但是分化后即失去增殖能力，并于48h后逐渐死亡。结论：通过体外培养可以获得大量高度均一的BM—MSC。BM—MSC可向神经细胞诱导分化，但尚缺乏实际应用的可能性。     

抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体对K562细胞在裸鼠体内生长的影响

目的观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体基因后,对其在裸鼠体内生长的影响。方法应用基因重组技术构建逆转录病毒载体ＭＳＣＶ－ｉｂＥ－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰ,将胞内抗体基因转导Ｋ５６２细胞,观察胞内抗体的表达和细胞内ｃ－ＡＢＬ及ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶活性的变化;将表达胞内抗体的细胞与对照组Ｋ５６２细胞及转导空载体的细胞分别移植裸鼠,动态观察肿瘤的生长。结果获得表达胞内抗体基因的细胞模型：Ｋ５６２－ｉｂＥ,其靶蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑。移植裸鼠后第１４,２１,２８天肿瘤体积均小于对照组的１／２。结论转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的细胞在裸鼠体内生长明显受抑制,这可能与胞内抗体显著抑制细胞内ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶活性,阻断ＢＣＲ／ＡＢＬ信号途径,促进细胞凋亡,降低了细胞的体内致肿瘤性有关。     

研究慢性粒细胞性白血病病理发生中下游信号传导和分子调控的干细胞模型

获得慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型 ,旨在研究慢粒白血病病理发生中信号传导的分子机制。方法　转导b3a2bcr/ablcDNA到正常人CD34 细胞中构建人原代慢性粒细胞性白血病模型。采用细胞免疫组化测定了p2 10 BCR/ABL在CD34 细胞中的表达 ;细胞粘附、迁移实验进行模型鉴定 ;FACS法测定了p2 10 BCR/ABL转导及对照CD34 细胞p2 7kip和MDR 1Pgp的表达。结果　相对于对照的CD34 细胞 ,转导了bcr/abl的CD34 细胞对纤粘连蛋白 (fibronectin ,FN)的粘附性下降 ;而在FN上的迁移能力增强 ;在低浓度细胞因子或血清条件下表现为凋亡延迟 ;细胞的粒系克隆形成单位数量明显增多 ,这一模型再现了原代慢粒白血病的异常表型特征 ,并以此模型发现p2 10 BCR/ABL转染CD34 细胞上调了p2 7Kip水平并可诱导MDR 1Pgp异常表达。结论　该模型适用于慢粒病理发生中的信号分子传导及分子调控研究 ,提示了慢粒耐药的分子机制。     

BCR/ABL融合基因表达检测技术建立及其初步应用

目的建立BCR/ABL融合基因表达定量分析的双色荧光定量PCR技术;探讨所建立的双色荧光定量PCR技术在CML早期诊断中的临床应用特点。方法据BCR/ABL融合基因序列,设计合成BCR/ABL融合基因及ABL基因特异的引物TaqM an探针。提取患者骨髓细胞标本总RNA,逆转录成cNDA;在同一PCR反应管中同时进行两种基因的双色荧光定量PCR反应,分别定量测BCR/ABL融合基因和ABL基因的表达量,并计算两种基因表达的比值。检测标本中两种基因的表达量,计算检测的阳性率,所得结果与临床诊断结果对比,以判断该技术在CML检测诊断中的价值。结果成功地建立了BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR技术方法;在35例临床CML患者中,33例检出融合基因阳性,检测阳性率94.3%;12例正常人cDNA均未检出融合基因阳性。结论所建立的BCR/ABL融合基因检测的双色荧光定量PCR是一种快速、准确、高通量而费用又较为低廉的基因检测技术,该技术检测CML具有临床可行性。     

人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性

目的：观察及研究人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性。方法：分离、培养、鉴定人嗅黏膜间充质干细 胞,在透射电子显微镜、扫描电子显微镜下观察其超微结构,并在体外诱导其向脂细胞、骨细胞、神经干细胞球和神 经元分化。结果：人嗅黏膜间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列,高表达表面标志CD73和CD90,不表 达CD34和CD45;在扫描电子显微镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,在透射电子显微镜下可见到两种不同的 细胞形态;具有成脂、成骨、成神经元干细胞球和神经元分化的能力。结论：人嗅黏膜间充质干细胞具有间充质干细 胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能,可作为组织工程修复的理想的种子细胞。     

Matrix metalloproteinase-9 was involved in the immuno-modulatory defect of mesenchymal stem cell from chronic myeloid leukemia patients

Background  Overwhelming evidences on chronic myeloid leukemia (CML) indicate that patients harbor quiescent CML stem cells that are responsible for blast crisis. While the hematopoietic stem cell (HSC) origin of CML was first suggested over 30 years ago, recently CML-initiating cells beyond HSCs are also being investigated.

Methods  We have previously isolated fetal liver kinase-1-positive (Flk1⁺) cells carrying the BCR/ABL fusion gene from the bone marrow of Ph⁺ patients with hemangioblast property. In this study, we isolated CML patient-derived Flk1⁺CD31⁻CD34⁻ mesenchymal stem cells (MSCs) and detected their biological characteristics and immunological regulation using fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis, fluorescence activated cell sorting (FACS), enzyme-linked immunoadsorbent assay, mixed lymphocyte reaction assays; then we compared these characters with those of the healthy donors. 

Results  CML patient-derived Flk1⁺CD31⁻CD34⁻ MSCs had normal morphology, phenotype and karyotype while appeared impaired in immuno-modulatory function. The capacity of patient Flk1⁺CD31⁻CD34⁻ MSCs to inhibit T lymphocyte activation and proliferation was impaired in vitro.

Conclusions  CML patient-derived MSCs have impaired immuno-modulatory functions, suggesting that the dysregulation of hematopoiesis and immune response may originate from MSCs rather than hematopoietic stem cells (HSCs). MSCs might be a potential target for developing efficacious treatment for CML.

     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性

目的：建立一种成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学活性及向脂肪细胞诱导分化的方法，并以此鉴定所获细胞。方法：采用1．073g／ml的Percoll分离液分离成人骨髓间充质干细胞。接种于纤维连接蛋白包被，含有表皮生长因子和血小板原性生长因子BB的2％胎牛血清培养液中，并利用其贴壁性进行纯化；观察其形态学变化及超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物；采用10％胎牛血清和尼克酰胺诱导其向脂肪细胞的分化。结果：原代和传代培养均保持较强的增殖能力，超微结构显示了干细胞的幼稚特性，流式细胞仪检测示CD34、CD45、CD19、组织相容性抗原-DR阴性，CD44、CD10、CD29、CD13阳性。体外能够分化成为脂肪细胞，油红O染色阳性。结论：采用该方法骨髓间充质干细胞生长稳定，扩增较快；一定条件下能够定向分化成为脂肪细胞；我们所获得的细胞具有间充质干细胞的特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能。 方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以 下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗+单纯输注MSC;实验组2(B组),放疗+输注天麻诱导1h MSC,A、B组每只小鼠注射0.3mL含1.5×106cells的无血清培养液。空白对照组,放疗+输注等量无血清培 养液。照射后4h内,分别经尾静脉注射。移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细 胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45表达。结果:所有实验小鼠均能存活到2个月,骨髓、外周血、脾细胞悬液 均可检测到低表达的大鼠源性CD11a、CD45。对照组为阴性。A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P< 0.05)。结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能。     

骨髓增殖性肿瘤中JAK2V617F突变与Ⅰ型细胞因子受体相关性研究

目的探讨促红细胞生成素受体(EPOR)、粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)、血小板生成素受体(MPL)在骨髓增殖性肿瘤(MPN)中的表达情况及其与JAK2V617F突变的相关性。方法选取44例BCR/ABL阴性MPN患者[包括16例真性红细胞增多症(PV)、14例原发性血小板增多症(ET)、14例原发性骨髓纤维化(IMF)患者]、11例慢性粒细胞白血病(CML)患者和20例健康志愿者(正常对照组)。应用定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)技术检测上述受检者的骨髓或外周血JAK2V617F突变及EPOR、G-CSFR、MPL的mRNA表达情况。结果在44例BCR/ABL阴性的MPN患者中有26例(59.1%)存在JAK2V617F点突变,而在11例CML患者和20例正常对照者中未检测到JAK2V617F突变。BCR/ABL阴性MPN初治患者EPOR、G-CSFR的mRNA表达水平高于正常对照组(P<0.05),而MPL的mRNA表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);CML患者EPOR、G-CSFR、MPL的mRNA表达水平均高于正常对照组(P<0.05),BCR/ABL阴性JAK2V617F突变阳性与阴性初治组患者EPOR、G-CSFR、MPL的mRNA表达无明显差异(P>0.05)。结论Ⅰ型细胞因子和(或)JAK2V617F参与了MPN的发病;Ⅰ型细胞因子受体在多种造血系统肿瘤疾病中高表达,但对MPN的发病并非决定因素。     

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

目的：建立慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia ,CML）患者BCR-ABL融合基因检测及微小残留病变实时定量监测的诊断平台。方法依据GenBank中编码P210蛋白的融合基因M（ b2a2,b3a3）及ABL的基因序列,分别设计引物及Taqman探针,以BCR-ABL阳性的CML患者cDNA为模板,通过PCR扩增出587 bp的基因片段,连入pMD 18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量PCR（ real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术监测BCR-ABL转录水平的变化。结果成功构建BCR-ABL标准品。应用RQ-PCR探针法,以ABL为内参,对CML患者进行BCR-ABL融合基因的检测,得到比较稳定的定量数据,与定性结果一致。结论自行构建BCR-ABL质粒为标准品,运用RQ-PCR实时监测BCR-ABL融合基因的表达变化,敏感性好,稳定性高,对临床检验具有普遍意义。