人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的：构建IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体，为研究细胞内IPl0的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法：采用基因重组技术构建含IPl0启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-IPl0；用脂质体瞬时转染HEK293细胞，观察IPl0启动子对脂多糖（LPS）刺激的反应。结果：酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的；该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低，经LPS刺激后，在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论：所构建的IPl0启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的，对生理相关刺激有很好的反应，可有效地用于IPl0基因表达信号调控机制的研究。     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

α肌动蛋白基因转录激活因子HMGB34367的克隆和调控功能研究

目的:探讨从博来霉素致肺纤维化小鼠肺组织中筛选出的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)亚家族成员HMGB34367,作为转录因子对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因表达的影响。方法:①克隆与构建HMGB34367真核表达载体及α-SMA启动子红色荧光报告质粒。②构建质粒共转染气道上皮细胞系16HBE,荧光显微镜观察重组转化生长因子-β1(rhTGF-β1)刺激下红色荧光的表达。③电泳迁移率(EMSA)及超迁移实验分析HMGB34367和α-SMA启动子CArGB基序的特异性结合活性。④RT-PCR检测细胞转染HMGB34367真核表达载体HMGB34367-pcDNA3.0对内源性α-SMA基因表达的影响。结果:细胞过表达HMGB34367能活化α-SMA启动子,转染HMGB34367-pcDNA3.0质粒的16HBE细胞核蛋白,显著增强了与α-SMA启动子CArGB序列特异结合,过表达HMGB34367诱导了α-SMA基因表达。结论:HMGB34367基因编码蛋白能作为转录因子特异性地诱导α-SMA启动子的转录激活,上调αS-MA基因表达。提示致纤维化环境因子通过诱导HMGB34367表达使αS-MA基因转录激活,可能在气道重塑和肺纤维化的病理过程中发挥重要作用。     

S100A8启动子的克隆及转录活性的检测

目的 构建小鼠S100 A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖（LPS）、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性。方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达。结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加。结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础。     

S100A8启动子的克隆及转录活性检测

目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础.     

人内皮细胞一氧化氮合酶红色荧光蛋白报告基因载体的构建与表达

目的：研究血管壁切应力诱导的人血管内皮细胞内皮细胞-氧化氮合酶（eNOS）基因表达的调控机制,构建在哺乳动物细胞中表达的eNOS红色荧光蛋白报告基因载体。方法：从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子,将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRedl-l上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后将重组载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达和分布情况。结果：PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDseNOSRed的构建正确,该载体能在293细胞中高效表达。由eNOS启动子驱动表达的红色荧光蛋白大部分均匀分布于整个细胞中,转染后12h开始出现,36-48h为表达高峰,120h后红色荧光几乎全部消失。结论：成功构建了eNOS红色荧光蛋白报告基因载体,该载体能在哺乳动物细胞中高效表达,为研究血管壁切应力诱导血管内皮细胞eNOS基因表达的调控机制提供了一个重要而又方便的工具。     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

大肠杆菌不同SOD调控序列红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

目的 通过将大肠杆菌BL21中MnSOD、FeSOD以及Cu/ZnSOD调控序列(包括启动子,-3518～+15 bp)与红色荧光蛋白(RFP)连接,构建成含SOD调控序列的红色荧光蛋白报告基因,用以研究不同SOD启动子对RFP的调控作用.方法 采用重组PCR技术,分别构建以MnSOD、FeSOD、Cu/ZnSOD启动子驱动的RFP报告基因载体,并将构建的融合基因通过T克隆转化入大肠杆菌,通过不同浓度Cd2+作用,分别诱导RFP表达.结果 正确构建了三种SOD -RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致;该报告基因在室温静息状态下,红色荧光有微弱表达,经Cd2+诱导后,红色荧光亮度明显增强,其中MnSOD调控序列驱动的RFP表达最为明显.结论 该报告基因载体的成功构建,为研究SOD的基因表达调控机制和研制检测环境中污染物的微生物传感器提供了重要基础和工具.     

转化生长因子β调控miR-200b-200a-429启动子活性

目的 探讨转化生长因子β（TGF-β）对miR-200b-200a-429簇表达的影响,对其调控机制作初步研究。 方法 使用RT-PCR方法检测TGF-β对人肾小管上皮细胞HK-2 miR-200a、miR-200b和miR-429表达的影响。PCR方法扩增出miR-200b-200a-429簇启动子序列,构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶报告基因表达载体,转染至HK-2细胞,检测其荧光素酶活性。观察TGF-β对miR-200b-200a-429转录的表达调控。 结果 实时定量PCR检测结果显示TGF-β作用细胞24 h后下调了miR-200a、miR-200b和miR-429的表达。成功构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性,发现TGF-β可以抑制miR-200b-200a-429启动子活性（P<0.05）。 结论 TGF-β可以调控miR-200b-200a-429启动子的活性。     

乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

为研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达。用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子，载入T载体，测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1。构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体，经酶切、测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2，用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达。     

PTEN抑制增生性瘢痕成纤维细胞转分化作用及其机制

目的观察染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)编码蛋白对TGF-β1刺激下瘢痕成纤维细胞转分化的抑制作用及其机制。方法用重组PTEN腺病毒转染体外培养的人瘢痕成纤维细胞,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;将实验分为对照组、PTEN转染组、空载体转染组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),RT-PCR和Western blot分别检测对照组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN mRNA和蛋白表达;Western blot检测各组中α-SMA、Akt、p-Akt表达水平。结果 PTEN基因转染瘢痕成纤维细胞36h后可见明显绿色荧光蛋白表达,PTEN转染组PTEN mRNA及蛋白的表达明显升高,与对照组及空载体转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而p-Akt和α-SMA的表达明显下降(P<0.05);TGF-β1组α-SMA表达较对照组明显升高,同时伴有p-Akt表达上升,与对照组、PTEN转染组、PTEN+TGF-β1组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);空载体转染组与对照组相比,p-Akt、α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);空载体+TGF-β1组与TGF-β1刺激组相比,p-Akt、α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。各组细胞的Akt表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TGF-β1可促进PI3K/Akt通路活化,使瘢痕成纤维细胞α-SMA表达升高,促进其转分化;空载体转染对p-Akt、α-SMA的表达无明显影响,高表达PTEN可使瘢痕成纤维细胞α-SMA的表达明显降低,并且可拮抗TGF-β1对瘢痕成纤维细胞的转分化作用,其机制可能是抑制PI3K/Akt通路活化。     

肾小管上皮细胞间质转分化过程中E-cadherin和α-SMA基因启动子区甲基化状态研究*

目的：了解大鼠肾小管上皮细胞间质转分化与E-钙黏附蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）基因启动子区甲基化状态之间的关系。方法：将大鼠肾小管上皮细胞分为对照组和TGF-β1处理组。对两组细胞采用免疫细胞化学方法检测E-cadherin和α-SMA蛋白表达情况,用ELISA法检测培养液中Ⅰ型胶原蛋白的含量。同时分别提取两组细胞中的基因组DNA,应用焦磷酸测序技术对E-cadherin和α-SMA基因启动子区甲基化水平进行检测。结果：TGF-β1处理组细胞中E-cadherin基因启动子区有2个CpG位点甲基化频率高于对照组,而α-SMA基因启动子区有2个CpG位点甲基化频率低于对照组。结论：E-cadherin和α-SMA基因启动子区甲基化状态的改变参与了肾小管上皮细胞间质转分化过程。     

槲皮素抗肾小管上皮细胞转分化的机制研究

目的探讨槲皮素对转化生长因子β（TGF-β）诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（TEMT）的影响。方法TGF-β刺激体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞株（NRK5ZE）,同时以不同浓度槲皮素进行干预,细胞免疫化学染色法和PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达。结果TGF-β刺激导致α-SMA表达增加,不同浓度槲皮素作用后,可减轻TGF-β诱导的α-SMA表达,上调E-cadherin的表达（P〈0．05）。结论槲皮素对TGF-β刺激的NRK52E细胞转分化有明显抑制作用。     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

Smads信号通路在转化生长因子-β1诱导气道上皮细胞转分化中的作用

目的:探讨Smads信号通路在rhTGF-β1体外诱导气道上皮细胞表型向肌成纤维细胞转分化中的作用.方法:用TGF-β1(10 μg/L)处理气道上皮细胞株16HBE,Western blot法检测刺激不同时间点细胞核蛋白内磷酸化Smad 2和Smad 3(30min、24h和48 h)的表达;脂质体法瞬时转染Smad 7表达载体pCDNA 3.0/Smad 7或空载体,转染20h后,加入TGF-β1处理,RT-PCR法检测刺激不同时间E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的基因表达,免疫荧光法检测α-SMA的蛋白表达. 结果:①正常对照组核内无磷酸化-Smad 2表达,Smad 3有微弱表达,TGF-β1刺激30min时表达量明显增加,随着刺激时间的延长,表达量进一步增加;②TGF-β1刺激24h,瞬时转染Smad 7组α-SMA表达量低于相应转染空载体组,E-钙黏蛋白表达量明显高于相应转染空载体组,TGF-β1刺激36h后Smad 7组α-SMA、E-钙黏蛋白表达量与相应空载体组相似;免疫荧光显示转染Smad 7组α-SMA阳性细胞数显著低于空载体组(P<0.05). 结论:Smads信号通路参与了TGF-β1诱导的支气管上皮细胞株16HBE向肌成纤维细胞转分化过程.     

shRNA干扰β-catenin对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的作用

目的构建特异性针对β-catenin基因的shRNA干扰载体,转染TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞株HKCs,研究其对肾小管上皮细胞转分化的影响。方法将构建的shRNA-β-catenin干扰载体转染TGF-β1诱导的HKC细胞,RT-PCR、Western blot检测β-catenin的mRNA及蛋白表达水平,筛选抑制效果最佳载体;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测肾小管上皮细胞转分化相关蛋白E-cadherin、α-SMA的mRNA及蛋白表达水平。结果经酶切和测序鉴定,成功构建的shRNA-β-catenin表达载体转染HKC细胞,β-catenin在mRNA及蛋白表达水平均低于转染空白载体组(P<0.05),并筛选shRNA-β-catenin-1进入实验组;转染shRNA-β-catenin-1组细胞β-catenin在mRNA及蛋白表达水平均低于TGF-β1诱导组和空载体组(P<0.05),且β-catenin转核显著减弱(P<0.05);E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平较TGF-β1诱导组和空载体组显著上调(P<0.05)、α-SMA的mRNA及蛋白表达水平较TGF-β1诱导组和空载体组显著下调(P<0.05)。结论运用shRNA-β-catenin干扰载体转染TGF-β1诱导的HKC细胞,能够抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

视黄酸和α-干扰素对带有视黄酸反应元件的LUC报告基因表达的调控作用

目的：探讨视黄酸（Retinoic acid,RA）通过视黄酸反应元件（RARE）调控外源基因表达的可行性。方法：构建带有视黄酸受体β（RARβ）基因增强子区域RARE的荧光素酶（Luciferase,LUC）报告基因表达载体，应用脂质体包裹RARE－TK－LUC和RARE3－TK－LUC质粒，并转染HL－60细胞，48h后，用RA和／或α-干扰素（IFNα)处理不同时间，用LUC报告基因检测试剂盒分析LUC报告基因活性。结果：经RA处理不同时间后，RARE－TK－LUC和RARE3－TK－LUC质粒转染细胞的LUC相对活性分别较未经处理的转染细胞增加12－38和20－85倍；单用IFNα处理转染细胞，对LUC的表达无明显的诱导作用；IFNα和RA联合处理48、72h，LUC相对活性比单用RA处理增加60％－70％。结论：RA可调控带有RARE的LUC报告基因的表达，说明应用RARE构建RA可调控的目的基因表达载体是可行的。     

pGFP-FL质粒的构建及其在FL基因修饰性肿瘤疫苗中的应用

目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以CMV启动子驱动FL基因,同时以肽链延长因子（EF-1α）启动子驱动GFP基因,并引入原核和真核选择基因KanR/neo。对所获得的pGFP-FL质粒以限制性内切酶酶切鉴定后,再将其导入Hepa1-6细胞内,直接在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况,同时以RT-PCR和PCR产物测序的方法对GFP阳性细胞内FL基因的表达进行检测。结果　质粒的酶切鉴定结果表明所构建的pGFP-FL与预期的结构一致,FL和GFP两者能同时在Hepa1-6细胞内表达。结论　本研究构建了一种新型的FL基因修饰肿瘤疫苗研究载体,位于该载体上的GFP的表达能够反映FL基因的转录表达情况,可以作为FL基因表达的报告基因。     

应用珠蛋白启动子驱动荧光蛋白在K562细胞中表达

目的应用红系特异性启动子驱动荧光蛋白（绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP）在血液病细胞K562中表达,以验证克隆所得红系特异性启动子的有效性。方法应用PCR的方法扩增红细胞系特异性启动子,构建该启动子驱动GFP基因表达载体和驱动RFP基因表达载体。然后转染K562细胞,用荧光显微镜、RT-PCR分析基因表达的情况。结果荧光显微镜示在K562细胞中可见较强的绿色荧光和红色荧光表达,RT-PCR进一步验证了GFP和RFP能在K562细胞中有效的表达。结论克隆的红细胞系启动子是有效的,能有效地启动目的基因在血液病细胞中表达,为下一步进行血液病基因治疗提供科学的资料。     

pGFP—FL质粒的构建及其在FL基因修饰性肿瘤疫苗中的应用

目的 构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法 利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒，在该质粒中，以CMV启动子驱动FL基因，同时以肽链延长因子（EF-1α）启动子驱动GFP基因，并引入原核和真核选择基因Kan^R/neo，对所获得的pGFP-FL质粒以限制性内切酶酶切鉴定后，再将其导入Hepal-6细胞内，直接在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况，同时以RT-PCR和PCR产物测序的方法对GFP阳性细胞内FL基因的表达进行检测，结果 质粒的酶切鉴定结果表明所构建的pGFP-FL与预期的结构一致，FL和GFP两者能同时在Hepal-6细胞内表达。结论 本研究构建了一种新型的FL基因修饰肿瘤疫苗研究载体。位于该载体上的GFP的表达能够反映FL基因的转录表达情况，可以作为FL基因表达的报告基因。