磷酸胆碱聚合物作为药物运输载体转染大鼠心肌细胞的体外研究

目的探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否安全有效地转染进入心肌细胞.方法应用原子转移自由基聚合法 (ATRP)合成具有高度生物相容性的双嵌段的MPC30-DEA70,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记,并对材料的溶液进行表征;采用MTT法检测MPC30-DEA70与心肌细胞的相容性;应用荧光显微镜(FM)、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)、透射电镜(TEM)观察MPC30-DEA70在细胞内的分布和定位;流式细胞术(FCM)检测MPC30-DEA70的细胞转染效率和荧光强度.结果 MPC30-DEA70与心肌细胞具有较好的细胞相容性,在较高浓度下才表现出一定的细胞毒性并呈现剂量依赖性;MPC30-DEA70可以进入到心肌细胞内部,大部分分布于核周围,少部分可以进入细胞核,对心肌细胞的超微结构无明显影响;MPC30-DEA70在心肌细胞内具有较高的转染效率和荧光强度,并呈剂量依赖性.结论 新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70可以安全有效转染心肌细胞,是一种理想的非病毒类药物或基因运输载体.     

磷酸胆碱聚合物载AT1受体siRNA对血管内皮细胞AT1受体表达的影响

目的探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体siRNA对血管内皮细胞AT1受体表达的影响。方法应用琼脂糖凝胶电泳表征具有不同N/P比值的MPC30-DEA70与siRNA的复合物;将不同比例的MPC30-DEA70/siRNA基因复合物转染至人脐静脉内皮细胞,应用荧光显微镜(FM)检测其细胞内分布;流式细胞术(FCM)检测转染效率及荧光强度;Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA的表达情况。结果不同N/P比值的基因复合物在电泳中可见不同程度的迟滞现象,随正电性增强而显著。FM观察到MPC30-DEA70/siRNA复合物分布在细胞核周围,FCM结果显示随N/P比值的增大,转染效率明显增加,荧光强度也随之增强。RT-PCR法和Western blot法显示随着N/P比值的增大,基因复合物可使AT1受体的mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 MPC30-DEA70可作为AT1受体siRNA的载体转染至血管内皮细胞,下调AT1受体的mRNA及蛋白的表达,提示阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输siRNA,抑制特异基因的表达,是一种有效的非病毒类转基因载体。     

磷酸胆碱聚合物载TGF—β1反义寡核苷酸转染血管外膜成纤维细胞对TGF—β1的影响

目的观察新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地转染针对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的反义寡核苷酸（AS—ODN）进入到血管外膜成纤维细胞中及转染后对血管外膜成纤维细胞内TGF-β1表达的影响,为MPC30-DEA70,聚合物作为药物基因治疗载体在心血管疾病中的运用奠定基础。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MPC30-DEA70／TGF-β1AS-ODN（FAM标记）在细胞内的分布和定位;流式细胞仪（FCM）检测二者的细胞转染效率、荧光强度;免疫印迹实验（Western blot）检测TGF-β1细胞内表达。结果①原代培养的细胞呈纺锤形,多角形或者不规则形,细胞核较大,数量1～2个不等,轮廓清楚,核仁大而明显,呈椭圆形;②激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围;③流式结果显示转染效率及荧光强度随N／P比增加而明显增大;④Western blot结果显示随着N／P比值的增大,TGF-β1的蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论MPC30-DEA70,能够携带TGF-β1-AS—ODN进入离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞,并能下调TGF—β1蛋白的表达。     

新型双嵌段磷酸胆碱基共聚物作为siRNA基因运输载体研究

将载体MPC30-DEA70(N)与siRNA (P)在N/P比值不同的条件下复合,用DNA凝胶电泳法,倒置显微镜,MTT法表征复合物溶液;同时分析胎牛血清(FBS)对细胞转染的影响.结果 显示在无胎牛血清条件下siRNA能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大中和的越多,而有胎牛血清的条件下siRNA几乎不能与载体MPC30-DEA70电性中和;倒置显微镜观察到siRNA分子能进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着载体浓度增大,对细胞的增殖抑制性增强.以上结果显示,新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70可以有效负载和运输siRNA,是一种安全有效的非病毒类转基因载体.     

双嵌段磷酸胆碱基聚合物作为c-myc AS-ODN基因运输载体研究

目的 探讨双嵌段磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70 作为反义寡核苷酸（AS-ODN）运输载体的安全性和有效性.方法 将载体MPC30-DEA70（N）与c-myc AS-ODN（P）在不同N/P比值的条件下复合,应用DNA凝胶电泳法、荧光显微镜、流式细胞术和四甲基偶氮唑盐（MTT）法对复合物溶液进行检测,观察复合物在HeLa细胞中的转染情况.结果 c-myc AS-ODN能与载体MPC30-DEA70电性中和,N/P比值越大复合物正电性越强;MPC30-DEA70/AS-ODN复合物能够进入细胞,转染效率随着N/P比值增大而增大;同时随着N/P比值增大复合物对细胞的增殖抑制作用显著增强.结论 MPC30-DEA70可以有效负载和运输c-myc AS-ODN,抑制HeLa细胞增殖,是一种新型的、安全有效的非病毒类转基因载体.     

阳离子多聚物jetPEITM对原代培养的猪血管平滑肌细胞的转染效率研究

目的 研究转染试剂jetPEITM对原代培养的猪血管平滑肌细胞的转染效率.方法 原代培养小型猪胸主动脉血管平滑肌细胞,体外合成双链寡核苷酸,jetPEITM与寡核苷酸按不同的氨基与磷酸基的比例(N/P)混合转染细胞,采用流式细胞仪和共聚焦荧光扫描仪检测jetPEITM对寡核苷酸的转染效率及细胞内定位情况,MTT法检测jetPEITM的细胞毒性作用.结果 原代培养的猪血管平滑肌细胞jetPEITM转染率在N/P=10时可高达(90.89±2.23)%,转染底物主要分布在细胞浆内,核内转染效率极低,在N/P比值在5～10之间时,细胞毒性作用不高于20.00%.结论 在原代培养的猪的血管平滑肌细胞,jetPEITM可以高效运送寡核苷酸进入细胞浆内,细胞毒性作用低.     

磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸对自发性高血压大鼠血压及心血管重构的影响

目的 探讨磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体反义寡核苷酸(AS-ODN)对自发性高血压大鼠(SHR)血压及心血管重构的影响.方法 将MPC30-DEA70(N)与FAM-AS-ODN(P)按不同N/P比值络合后经尾静脉注入SD大鼠体内,未经处理的SD大鼠为对照,3周后观察复合物在全身各组织器官的分布.再将MPC30-DEA70与AT1受体AS-ODN按不同N/P比值络合后经尾静脉注入8周龄SHR大鼠体内,未经处理的SHR大鼠为对照,3周后测量尾动脉压,对主动脉及心肌组织行天狼星红染色,并用Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA表达情况.结果 MPC30-DEA70/FAM-AS-ODN复合物能够进入肾脏组织;空白对照组和N/P=1∶0组的尾动脉压持续上升,缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组的尾动脉压较空白对照组明显下降;空白对照组和N/P=1∶0组心肌细胞肥大,主动脉壁增厚,胶原纤维大量沉积,而缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组上述情况较空白对照组明显改善;N/P=10∶1组和N/P=1∶1组AT1a蛋白和mRNA表达较空白对照组显著降低.结论 MPC30-DEA70能够安全有效地进入肾脏各组织,在体内运载AT1受体AS-ODN,下调AT1受体蛋白及其mRNA表达,抑制SHR大鼠血压进展及心血管重构,是一种创新性的非病毒类基因运输载体.     

Myocardin在血管平滑肌细胞增殖分化中的作用研究

目的研究Myocardin对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、分化的影响,并探讨其作用机制。方法取SD大鼠胸主动脉,采用组织块贴壁法原代培养VSMCs;取第3代原代培养的VSMCs转染Myocardin基因,建立SMMyocd、SM-Myocd-DN、SM-TR细胞系作为实验模型,DOX(Doxycycline)干预处理,采用免疫荧光法鉴定VSMCs及SM-Myocd、SM-Myocd-DN、SM-TR细胞系,应用细胞计数检测细胞增殖活性;Western blot法检测SM-Myocd、SM-Myocd-DN、SM-TR细胞蛋白表达水平的变化。结果组织块贴壁法成功培养VSMCs;转染Myocardin成功建立SM-Myocd、SM-Myocd-DN、SM-TR细胞系;DOX干预处理SM-Myocd、SM-Myocd-DN、SM-TR细胞系结果显示:Myocd过度表达抑制VSMCs的增殖,Myocd-DN过度表达刺激VSMCs的增殖,对SM-TR则无效。结论过度表达Myocd可抑制平滑肌细胞增殖分化,这可能是预防和治疗动脉粥样硬化斑块和血管再狭窄等血管性疾病的作用机制之一。     

MPC30-DEA70载AMO-miR-146a对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响

目的 阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30-DEA70)负载反义miR-146a寡核苷酸(AMO-miR-146a)转染大鼠颈总动脉球囊损伤处血管平滑肌细胞(VSMC),观察其对血管内膜增生的影响.方法 60只SD大鼠完全随机化分为未损伤组、单纯损伤组、多聚赖氨酸(PLL)组、AMO-miR-146a组、PLL载MPC30-DEA70/AMO-miR-146a复合物(P/M=3:1组和P/M=5:1组),每组10只.通过光学显微镜观察4周后大鼠颈总动脉组织形态学变化,q-PCR法检测miR-146a的表达以及应用Western blot法检测增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)、NFκBp65的表达情况.结果 苏木精-伊红染色,光镜下显示,除未损伤组外,单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组、P/M=3:1组、P/M=5:1组大鼠颈总动脉血管新生内膜有不同程度的增生,而中膜面积无明显改变;与单纯损伤组比较,PLL组、AMO-miR-146a组新生内膜面积差异无统计学意义(P>0.05),P/M=3:1组和P/M=5:1组新生内膜面积明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),后两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);q-PCR及Western blot检测显示P/M=3:1组和P/M=5:1组miR-146a及目的蛋白PCNA、NFκBp56的表达较未损伤组高,差异有统计学意义(P<0.05),但明显低于单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组,差异有统计学意义(P<0.05),而P/M=3:1组和P/M=5:1组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05);单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 MPC30-DEA70可与AMO-miR-146a络合,借助PLL进入VSMC,有效抑制球囊损伤后VSMC的miRNA-146a的表达,使PCNA、NFκBp56下调,抑制新生内膜增生,防止血管狭窄.     

粟米草三帖皂苷对PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 研究粟米草三帖皂苷(MPTS)在体外对血小板源生长因子(PDGF)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响及其机制.方法 原代培养大鼠血管平滑肌细胞,PDGF或PDGF与不同浓度MPTS(1～27μmol/L)共同作用后,以MTT法检测细胞活力;western-blot检测细胞pERK1/2表达变化.结果 成功培养血管平滑肌细胞;10ng/mL的PDGF促进VSMCs的增殖,而不同浓度MPTS作用后均可抑制PDGF诱导的VSMCs增殖(P<0.05);并且,MPTS对PDGF诱导的pERK1/2活化有抑制作用(P<0.05).结论 MPTS对PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用,其部分机制可能与下调pERK1/2活性有关.     

二步酶消化法分离大鼠主动脉血管平滑肌细胞及活性鉴定

目的:建立一种有效、方便的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的酶解分离方法.方法:采用二步酶消化法分离VSM-Cs,显微镜下观察细胞形态,锥虫蓝染色观察细胞成活率,荧光显微镜检测细胞内钙荧光强度(FI)在KCl激下的变化,全细胞膜片钳记录电压-依赖性钾电流.结果:分离的VSMCs镜下呈典型的梭状或长条状,成活率达68.0％;VSMCs内钙FI在KCl刺激下可增高;并可记录到稳定的电压-依赖性钾电流.结论:本法可获得大量形态和结构良好的VSMCs,且胞膜离子通道功能良好.     

静压力对Caveolin-1调节ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞荷脂的影响

目的 观察静压力对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)荷脂情况的影响.方法 原代培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,取第4～10代与ox-LDL 50 μg/mL共孵育,用自行研制的压力可调细胞培养箱以不同压力加压处理(0 kPa、8 kPa、16 kPa和24 kPa).HPLC法观察静压力对VSMCs荷脂的影响;用免疫印迹法检测小凹蛋白1(caveolin-1)的表达与磷酸化情况;用下调caveolin-1活性的药物干预后再用HPLC法观察血管平滑肌细胞胆固醇含量.结果 静压力可以减少ox-LDL诱导的VSMCs内胆固醇含量,上调caveolin-1的磷酸化;其中以16 kPa压力时作用最明显.SB203580可显著抑制caveolin-1磷酸化,从而导致16 kPa静压力下VSMCs内胆固醇含量增加.结论 静压力可通过调节caveolin-1磷酸化抑制ox-LDL诱导的VSMCs胆固醇蓄积.     

oxLDL通过PPARγ-ABCG1通路促进血管平滑肌细胞泡沫化

目的探讨氧化低密度脂蛋白(ox LDL)促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)泡沫化是否与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)-三磷酸腺苷结合盒转运子G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)通路调节相关。方法组织贴块法培养原代VSMCs;细胞免疫荧光染色鉴定原代VSMCs;BODIPY染色定性检测细胞内脂质沉积,酶促比色法定量检测细胞内总胆固醇沉积的量;Western blot检测VSMCs中PPARγ、ABCG1蛋白表达情况。结果 1Ox LDL作用VSMCs 48 h后脂质沉积增加;2Ox LDL作用VSMCs PPARγ蛋白表达量下降约53%(P<0.01),ABCG1蛋白表达量下降约48%(P<0.05);3罗格列酮激动PPARγ后,ABCG1蛋白表达量较单独的ox LDL组增加约147%(P<0.05),VSMCs中脂质沉积明显减少。结论ox LDL通过PPARγ-ABCG1通路促进血管平滑肌细胞泡沫化。     

TGF-β1 promotes endothelial cells adhesion to smooth muscle cells

目的 探讨TGF-β1基因作用于平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附的作用.方法 用单价阳离子脂质体转染试剂DOTAP转染pMAMneo TGF-β1于原代培养的平滑肌细胞,经G418筛选.检测转染pMAMneo TGF-β1和转染pMAMneo的平滑肌细胞黏附内皮细胞的情况.结果 经G418筛选,转染pMAMneo TGF-β1组转化生长因子TGF-β1基因在平滑肌细胞得到有效表达,内皮黏附实验表明转染pMAMneo TGF-β1组平滑肌细胞表面有大量内皮细胞黏附[(32±2)/高倍视野],而对照组平滑肌细胞仅有少量内皮细胞黏附[(11±1)/高倍视野],其与转染pMAMneo组相比,差异显著(P＜0.01).结论 TGF-β1基因能有效作用于血管平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附,在血管再生中具有重要作用.     

真核表达载体pEGFP-N2/AT2R的构建及其在原代血管平滑肌细胞的表达

目的体外构建携带血管紧张素Ⅱ2型受体(ANGⅡType 2 Receptor,AT2R)基因的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,并观察其在大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中的表达。方法以pUHD-10.3/AT2R质粒为模板,PCR扩增AT2R基因的全长cDNA序列,再将其克隆入载体pEGFP-N2,构建其真核表达载体pEGFP-N2/AT2R。以基因转染技术,将AT2R导入原代VSMCs。倒置荧光显微镜观测转染后VSMCs生长变化及AT2R在其中的表达等情况。图像分析技术检测AT2R在VSMCs中的转染效率。Western blot检测转染AT2R基因的VSMCs表达其编码蛋白。RT-PCR法对AT2R基因修饰的VSMCs进行鉴定。结果成功构建AT2R基因的真核表达载体pEGFP-N2/AT2R,该真核载体能携带AT2R基因转染并有效表达于VSMCs,其转染效率约40%,RT-PCR及Western blot均可检测到AT2RmRNA及蛋白在血管平滑肌细胞中高表达。结论成功地将克隆到的AT2R基因克隆入pEGFP-N2载体中,并实现了AT2R基因在原代VSMCs的表达。     

牙龈卟啉单胞菌对兔血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的研究牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)上清液对兔血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响.方法组织块法进行兔腹主动脉VSMCs的原代培养,复苏培养P.gingivalis标准菌株,不同浓度细菌上清液刺激细胞48h,MTT法检测细菌上清液对细胞增殖的影响;爬片法检测7 d内4.3×106CFU/mL的P.gingivalis上清对细胞迁移的影响.结果浓度高于4.3×106CFU/mL的P.gingivalis上清液能抑制VSMCs的增殖;4.3×106CFU/mLP.gingi-valis上清作用于VSMCs前4 d能促进VSMCs的迁移,明显高于对照组(P<0.05).结论高于4.3×106CFU/mL的P.gingivalis上清液能抑制VSMCs的增殖,4.3×106CFU/mL P.gingivalis上清液可促进血管平滑肌早期的迁移,从而在动脉粥样硬化的发生发展过程中可能发挥一定的作用.     

转化生长因子β1基因促进人平滑肌细胞与内皮细胞黏附

目的探讨TGF-β1基因作用于平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附的作用。方法用单价阳离子脂质体转染试剂DOTAP转染pMAMneo TGF-β1于原代培养的平滑肌细胞,经G418筛选。检测转染pMAMneo TGF-β1和转染pMAMneo的平滑肌细胞黏附内皮细胞的情况。结果经G418筛选,转染pMAMneo TGF-β1组转化生长因子TGF-β1基因在平滑肌细胞得到有效表达,内皮黏附实验表明转染pMAMneo TGF-β1组平滑肌细胞表面有大量内皮细胞黏附[(32±2)/高倍视野],而对照组平滑肌细胞仅有少量内皮细胞黏附[(11±1)/高倍视野],其与转染pMAMneo组相比,差异显著(P<0.01)。结论 TGF-β1基因能有效作用于血管平滑肌细胞从而促进内皮细胞黏附,在血管再生中具有重要作用。     

高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化及其电镜表现

目的观察高磷条件体外培养的原代大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是否发生钙含量的变化及其电镜下的微观表现。方法应用大鼠原代血管平滑肌细胞进行体外实验,将培养细胞分为对照组和高磷组。在培养的10d内观察细胞的形态学变化,并应用原子分光光度计检测细胞钙含量,应用电镜观察细胞的微观变化。结果对照组细胞VSMCs钙含量在10d内无明显增加,高磷组VSMCs钙含量在培养第8天后明显增加,与换液当天比较差异有统计学意义(P<0.01)。2组细胞电镜下第10天VSMCs细胞外基质中均可见大量胶原纤维,高磷组还可见高密度电子致密物呈颗粒状沿胶原纤维沉积。结论高磷条件可诱导体外培养的大鼠VSMCs细胞钙含量增加。电镜下高密度电子致密物呈颗粒状并沿胶原纤维沉积。     

SiRNA对大鼠钙调神经磷酸酶活性及VSMCs增殖的影响

目的:观察神经肽Y(NPY)刺激的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖中钙调神经磷酸酶(CaN)活性和c-fos表达水平的变化,以及RNA干扰抑制CaN活性的作用.方法:采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞;NPY刺激培养的大鼠VSMCs增殖;RNA干扰特异性抑制CaN的活性及其mRNA的表达,阻断NPY刺激的大鼠VSMCs中CaN依赖的信号转导通路,观察对CaN活性、细胞增殖、核内原癌基因c-fos表达水平的变化.结果:NPY可增加VSMCs的CaN活性,加快细胞增殖及增加核内c-fos表达水平.RNA干扰抑制CaN活性后,明显降低NPY刺激的VSMCs增殖及核内c-fos表达水平.结论:CaN参与了NPY刺激的VSMCs增殖,RNA干扰通过抑制CaN的活性可阻断NPY诱导的VSMCs增殖作用.     

体外传代培养对大鼠血管平滑肌细胞OPN mRNA表达的影响

目的探讨体外传代培养对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表型标志分子骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）mRNA表达的影响。方法选择未经培养传代的VSMCs和体外传代一至五代的VSMCs作对比研究。用RT-PCR法检测VSMCs中OPN mRNA相对表达水平。结果体外培养至第一代时,VSMCs的OPN mRNA表达量较原代VSMCs显著增高（P〈0.01）,且随传代代数的增加有逐渐增高趋势。结论 OPN在原代VSMCs中表达甚微,体外培养可促使VSMCs多量表达OPN,OPN为VSMCs合成表型标志分子,即体外培养可促使VSMCs从收缩表型转为合成表型。