长春花碱诱导TK6细胞tk位点杂合性丢失的研究

目的建立用人类淋巴母细胞TK6检测纺锤体毒物——长春花碱的TK基因突变试验方法,同时探讨长春花碱的遗传毒性分子机理。方法使用长春花碱0．625ng／mL、1．250ng／mL、2．500ng／mL和5．000ng／mL对TK6细胞染毒24h,进行TK基因突变试验。检测细胞相对存活率（RS％）、相对悬浮增长率（RTG％）、tk位点突变频率（MF）和缓慢生长集落的百分比（SC％）,同时对突变集落tk位点杂合性丢失（LOH）进行分析。结果随着长春花碱浓度的增加,TK6细胞的相对存活率和相对悬浮增长率均降低,而髓位点突变频率逐渐增加,且有剂量反应关系。tk位点杂合性分析表明长春花碱诱发的突变集落中有96．4％为LOH丢失,其中半合子LOH为39．3％,纯合子LOH为57．1％。结论长春花碱可诱导TK6细胞tk基因突变,主要以LOH为主。     

硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因杂合性缺失分析

目的探讨tk基因分子突变的类型,对不同剂量硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk+/-细胞tk基因突变的杂合缺失进行分析。方法使用硝酸羟胺50～500mg/L剂量对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别测定细胞毒性,细胞接种效率,相对悬浮生长率和突变频率。挑选经硝酸羟胺诱导的tk基因突变子(tk-/-)和自发突变体,提取基因组DNA,经等位基因特异性PCR扩增,杂合性缺失(LOH)分析等技术,分析其杂合性缺失的发生。结果大集落和小集落诱导突变体tk基因LOH发生率分别为62.2%和98.9%。由LOH分析的实验结果显示,诱导突变体的LOH在LC与SC之间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论功能性等位基因缺失是HAN诱导tk基因分子突变的重要形式之一,在不同集落类型之间可能具有不同的突变机制。     

L5178Y与TK6细胞的TK基因突变实验比较

目的 比较L5178Y与TK6细胞在TK基因突变试验系统中的异同和优劣。方法 采用L5178Y和TK6细胞做TK基因突变试验微孔平板法，对四种受试物(MMS、EMS、MMC、KCI)的致突变性进行检测与评价。结果 两种细胞对四种受试物的检测结果基本一致，但TK6细胞对四种受试物的耐受性均低于L5178Y细胞，且相对突变指数显著高于L5178Y细胞。结论 两种细胞应用于本试验各有其优越性，但由于TK6细胞来自于人类，实际应用意义大于L5178Y细胞，建议推广TK6细胞的应用。     

环磷酰胺诱导TK6细胞TK基因杂合性丢失的实验研究

目的　应用人类淋巴母细胞TK6研究环磷酰胺(CP)遗传毒性分子机理。方法　CP S9体外染毒TK6细胞4 h后检测细胞相对存活率、tk位点突变频率并进行TK基因缺失突变体杂合性丢失(L OH)的分析。结果　环磷酰胺染毒导致TK 6细胞相对存活率下降,TK基因突变频率上升,并呈现剂量-反应关系。正常及缓慢生长突变集落倍增时间分别为(14 .6±1.74 ) h及(35 .8±3.78) h。环磷酰胺诱导产生半合子L OH的比例(5 0 % )是对照(2 0 .7% )的2 .4倍。结论　环磷酰胺对TK基因较大范围的损伤是导致基因突变的主要原因。     

纺锤体毒剂诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究

目的 研究纺锤体毒剂长春新碱和秋水仙碱对小鼠淋巴瘤L5178Y3．2．7c-tk^ /-细胞tk基因突变的影响。方法 使用长春新碱和秋水仙素对L5178Y细胞进行梯度染毒，再分别进行细胞毒性，细胞接种效率，相对存活率，相对悬浮生长率和突变频率测定。结果 随着长春新碱和秋水仙素剂量的增加，L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率均明显下降。在长春新碱0．5～2．5ng／ml，秋水仙素10～50ng/ml范围内可以诱导细胞tk基因的突变率达到自发突变率的1～3倍。结论 长春新碱和秋水仙素对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性，并可以诱导tk基因突变。     

硫芥诱导L5178Y细胞tk基因突变的研究

目的　检测硫芥对小鼠淋巴瘤L5 178Y3 .7.2c tk - 细胞的诱变性。方法　采用 96孔微孔板接种法检测平板接种效率和突变频率。结果　硫芥可诱导L5 178Y3 .7.2c tk - 细胞tk位点的突变 ,诱发突变是自发突变的 2～ 15倍。在tk位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落 ,以小克隆为主。结论　硫芥有明确的致突变性和较强的细胞毒性 ,产生了大范围的DNA损伤     

散发性耳聋患者GJB2基因与mtDNA、A1555G基因的研究

目的分析散发性耳聋患者GJB2基因突变率和线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA、A1555G基因突变率。方法 2009年12月-2012年3月收治散发性耳聋患者135例与健康对照人群162名外周血样本,PCR扩增GJB2和mtDNA12SrRNA基因,通过限制性内切酶酶切鉴定突变热点,对PCR产物直接测序进行突变确定。结果对GJB2检测结果显示,散发性耳聋患者样本中发现9种碱基改变(V27I、E114G、I203T V37I、176-191del16、235delC、299-300delAT、T123N和504insGCAA),其中235delC为主要突变方式,携带率为27.41%,其中纯合突变18例,杂合突变19例;162例正常对照中发现了15种碱基改变,其中4种为常见多态。所有297例样本中未发现有mtDNA 12SrRNA A1555G位点突变存在。结论 GJB2基因突变是引起散发性非综合征耳聋患者听力损失发生的重要原因,不同人种GJB2基因的突变热点存在差异,235delC是GJB2基因在中国人中的主要致病突变位点;GJB2基因在人群中存在较多类型的突变和较多形式的多态性;在散发性耳聋中mtDNA、12SrRNA A1555G位点的突变率明显低于全国平均水平。     

非综合征型耳聋GJB2基因和mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变分析

目的:分析南京聋校散发性耳聋患者GJB2基因突变率和线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA A1555G基因突变率.方法:收集聋校学生135名和健康对照人群162名外周血样本,PCR扩增GJB2和mtDNA 12SrRNA基因,通过限制性内切酶酶切鉴定突变热点,对PCR产物直接测序进行突变确定.结果:对GJB2检测结果显示:散发性耳聋患者样本中发现9种碱基改变(V27I、E114G、I203T V37I、176-191del16、235delC、299-300delAT、T123N和504insGCAA),其中235delC为主要突变方式,携带率为27.41%,其中纯合突变18例,杂合突变19例;162例正常对照中发现了15种碱基改变,其中4种为常见多态.散发聋135例和正常对照162例共计297例样本中未发现有mtDNA 12SrRNA A1555G位点突变存在;结论:GJB2基因突变是引起散发性非综合征耳聋患者听力损失发生的重要原因,不同人种GJB2基因的突变热点存在差异,235delC是GJB2基因在中国人中的主要致病突变位点;GJB2基因在人群中存在较多类型的突变和较多形式的多态性;在散发性耳聋中mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变率明显低于全国平均水平.     

硫芥诱导L5178Y细胞tk基因突变的研究

目的检测硫芥对小鼠淋巴瘤L5178Y3.7.2c-tk 1-细胞的诱变性.方法采用96孔微孔板接种法检测平板接种效率和突变频率.结果硫芥可诱导L5178Y3.7.2c-tk 1-细胞tk位点的突变,诱发突变是自发突变的2～15倍.在tk位点诱发了大克隆和小克隆两种不同表型的突变集落,以小克隆为主.结论硫芥有明确的致突变性和较强的细胞毒性,产生了大范围的DNA损伤.     

脑血管狭窄患者Nf1全基因的DHPLC分析(附5例报告)

目的 探讨脑血管狭窄患者Nf1基因的突变热点及突变方式.方法 从全血中提取DNA,采用变性高效液相色谱分析(DHPLC)对5例脑血管狭窄病例进行Nf1全基因突变筛查;对DHPLC检测有差异洗脱峰型的区域进行测序分析.结果 5例无危险因素的脑血管狭窄患者Nf1全基因筛查发现:①1例出现5号外显子无义突变位点,c.541C-T;②5例均有14号和15号外显子之间内含子的基因突变;③4例有7号外显子c.702G-A的同义突变位点;④1例出现32号(c.4177G-A,Val-Ile)和46号外显子(c.6918T-G,Asn-Lys)的错义突变.结论 在目前无其他基础疾病的脑血管狭窄患者体内的Nf1基因并非以稳定野生型存在,而是具有不同类型的突变,这些突变集中在第5、7、14、32和46等外显子上.     

TK6和WTK1细胞对H2O2诱导的DNA损伤和修复能力的比较

目的探讨人的近二倍体类淋巴母细胞TK6和WTK1细胞的DNA损伤和修复能力的差异和机制。方法采用25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L的H2O2分别处理TK6和WTK1细胞,对两种细胞进行单细胞凝胶电泳,检测TK6和WTK1细胞的彗星细胞率和彗星细胞尾长以及p53基因的蛋白表达。结果TK6细胞对H2O2诱导的DNA损伤具有较高的敏感性,具有更为快速有效的损伤后修复能力。在孵育0．5h至1h内两种细胞达最大有效修复。TK6细胞P53蛋白本底水平明显低于WTK1细胞,在H2O2处理后,其表达水平明显增强。结论TK6细胞对H2O2诱导的DNA损伤更为敏感,损伤后的修复更为快速、有效。p53基因的表达水平的差异是两种细胞DNA损伤和修复能力差异的重要机制。     

P53 Gene Mutations in Non-Hodgkin's Lymphoma

ＳｏｆａｒＰ５３ｇｅｎｅｉｓｓｔｉｌｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒ－ｔａｎｔｇｅｎｅｅｖｅｒｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｔｏｓｕｐｐｒｅｓｃａｎ－ｃｅｒ．Ｉｔｉｓｏｎｈｕｍａｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１７Ｐ１３．１,ｅｎｃｏｄｅｓ５３ｋｕｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ...     

Molecular analysis of THH—induced mutations at HPRT locus in human promyelocytic leukemia cells with multiplex polymerase chain reaction

Objective: To study the genotoxicity and antitumor activity of a Chinese medicinal herb, Triptery-gium Hypoglaucum (Level) Hutch (THH). Methods: The genotoxicity and antitumor activity of THH were investigated in human promyelocytic leukemia cells on the mutation of hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene by using single cell clone culture, two-way screening counting, multiplex PCR amplification and gel electrophoresis. Results: The results showed that different mutant spectra existed between the spontaneous mutation and induced mutation by THH. Only 7. 7% (1/13) of spontaneous mutants showed deletion mutations, whereas the induced mutants included 46. 6% (27/58) deletions. Mapping of all intra-genic deletion breakpoints showed a random distribution in all 9 exons, but toward the 3'-end of the HPRT gene. Deletion of exon 1 only appeared when whole gene was deleted. Deletions of exon 7/8 and 9 often showed linkage deletions (71. 4%). Conclusion: THH can induce the mutation, mainly dele     

P53 gene mutations in non-Hodgkin’s lymphoma

Summary To understand P53 gene change of non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) and human malignant lymphoma cell lines, the exons 5–7 of 29 patients with NHL and 9 kinds of human malignant lymphoma cell lines were studied by silver staining PCR-SSCP technique. Three cases of P53 gene point mutation was found in 29 cases of NHL. Mutation developed in exon 5 in 2 cases, and in exon 6 in 1 case. They were all diffuse lymphoma. In mutation cases, B-cell lymphoma accounted for 2 cases and the other one was T-cell lymphoma. There was no P53 gene mutation in low-grade follicular lymphoma. Seven strains out of 9 kinds of lymphoma cell lines had P53 gene point mutation. One strain had the mutation in exon 5; 5 strains in exon 6 and 1 strain in exons 5, 6, 7. There was a high mutation rate in lymphoma cell lines and low mutation rate in NHL patients. P53 gene plays an important role in lymphoma cell line establishment, cell regeneration and disease evolution. This project was supported by national initiative programs for scholars coming back from other countries (No. 95–135).     

反义阻断REV3基因表达对细胞自发突变和MNNG诱导突变的影响

目的 :通过反义核酸技术研究REV3基因对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因HPRT的自发突变频率及烷化剂甲基硝基亚硝基胍 (methy1-nitro -nitrosoguanidine ,MNNG)的诱发突变频率的影响。方法 :用REV3基因反义核酸表达质粒pMAM -REV3-转染人羊膜上皮细胞 (FL) ,建立了由地塞米松诱导下的REV3基因表达可被反义阻断的细胞系 (FL-REV3-) ,并应用经典的筛选HPRT基因位点的突变子的实验进行REV3基因对HPRT基因位点的自发与诱发突变影响的检测研究。结果 :在自发突变率的检测中 ,FL细胞系的自发突变率比它的诱发突变率低 3 0 1倍 (P <0 0 5 ) ,而在FL -REV3-细胞系中始终未能筛选到自发突变子 ;用 0 .4 μmol/LMNNG分别处理FL -REV3-和FL细胞系 ,前者诱发突变率比后者低 6 0 2倍 (P <0 0 5 )。结论 :REV3基因不仅参与细胞自发突变 ,而且参与细胞的诱发突变 ,与DNA的跨损伤修复有关     

Rett综合征患儿甲基化CpG结合蛋白2基因和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因的突变

目的 了解Rett综合征(RTT)患儿甲基化CpG结合蛋白2基因(MECP2)和细胞周期依赖性激酶样5蛋白基因(CDKL5)突变及热点突变,建立适合临床诊断的检测方法和策略.方法 对1987至2007年北京大学第一医院儿科神经专业组诊断的177例散发RTT患儿抽取外周抗凝血提取DNA,用PCR-DNA测序方法对MECP2的全部外显子进行突变筛查,如未发现突变,用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)法进行基因剂量分析.对MECP2未发现突变的患儿用变性高效液相色谱法(DHPLC)进行CDKL5突变筛查.结果 在177例患儿中发现145例MECP2突变,1例CDKL5突变,总的突变率82%.MECP2突变中错义突变频率最高(39%);其后依次为无义(28%)、移码(17%)和大片段缺失突变(14%).所有突变中8种最常见突变依次为p.T158M(13%)、p.R168X(12%)、c.806delG(7%)、p.R255X(6%)、p.R270X和p.R133C各(5%)、p.R306C(4%)、p.R106W(3%).11%的患儿存在一个或多个外显子的缺失.结论 中国RTT患儿MECP2突变谱和国外报道相似,有热点突变.c.806delG是中国人群特有的一个热点突变.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对肺腺癌细胞杀伤作用探讨

目的：探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因转染联合抗病毒药物更昔洛韦（GCV）对人肺腺癌细胞系的杀伤作用。方法：应用基因工程技术构建了携带单纯疮疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因的逆转录病毒重组体pLXSN-tk，通过脂质体法转染PA317细胞，G418筛选出产重组病毒颗粒的生产细胞PA317-tk细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测HSV-tk/GCV系统对人肺腺部细胞系GLC-82的生长抑制率。结果：重组逆转录病毒载体能有效地将HSV-tk基因导入GLC-82细胞系内并使其获得对GCV的敏感性。结论：肺腺癌细胞转染HSV-tk基因后，能有效地被GCV杀死。