DNA聚合酶γ的提取、纯化和鉴定

目的: 提取并纯化人宫颈癌细胞(HeLa)的线粒体DNA聚合酶gamma(DNA polymerase gamma, Pol gamma), 鉴定其纯度和活性. 方法: 运用离子交换层析等方法提取纯化HeLa细胞的线粒体Pol gamma, 并用Bradford法检测蛋白浓度. 经SDS-PAGE检测蛋白纯度和相对分子量, Western blotting验证蛋白. 用alpha-(32)P-dTTP掺入法, 液体闪烁计数器进行放射性测量以确定Pol gamma的活性. 结果: 成功提取并纯化HeLa细胞的线粒体Pol gamma, 经SDS-PAGE鉴定, 有一个大约140 kDa的亚基单位, Western blotting证实为Pol gamma. 对其进行150倍纯化, 收得率为6%, 酶的总活力为4.81 U, 比活力为36.17 U/mg. 结论: HeLa细胞的线粒体Pol gamma通过离子交换层析法提取和纯化后活性较高, 可用于体外药物线粒体毒性的检测.     

人肝癌组织α-L-岩藻糖苷酶的提取和鉴定

目的:提取人肝癌组织的α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fuCosidase,AFU)经纯化和鉴定后,为制备特异性多克隆抗体提供纯化的抗原.方法:运用超滤和离子交换层析等方法提取、纯化人肝癌组织的AFU,并经SDS-PAGE检测蛋白纯度及相对分子质量.根据荧光底物4-甲基微型酮-α-L-岩藻糖苷(4-methylumbelliferyl-α-L-fucopyranoside,4-MU-fuCoside)和纯化的蛋白在特定条件下反应生成产物4-甲基微型酮(4-methylumbelliferone,4-MU)的量来检测酶活性.检测蛋白浓度用Bradford方法.结果:提纯并纯化的AFU经SDS-PAGE鉴定有一个亚单位Mr 55 000.经过一系列纯化步骤后,肝癌组织的AFU可得到74倍纯化,15%收率.结论:肝癌组织的AFU可通过离子交换层析法提取和纯化并可用于制备抗体.     

衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化

目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体,经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白,研究其生物学功能.方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因,将PCR产物经纯化连接到pMD18-T,将重组质粒pMD-CPAF经NdeI和BamHI双酶切,与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接,建立pET42b(+)-CPAF表达载体,阳性克隆经鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白,进行SDS-PAGE分析,Western印迹检测.结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确.SDS-PAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带,pET42b(+)-CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右,采用镍柱的亲和纯化后,可达70%左右.结论 经DNA测序、SDS-PAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株,并获得纯化CPAF的方法,为今后CPAF的研究及应用奠定了基础.     

增龄大鼠心肌线粒体DNA损伤及DNA修复酶γ表达的变化

目的:探讨大鼠增龄过程中心肌组织DNA损伤和DNA修复酶表达的变化。方法:从不同月龄的大鼠心肌组织中提取DNA、RNA及蛋白。采用定量多聚酶链反应(Q-PCR)检测心肌DNA损伤;用RT-PCR和Western blot检测DNA修复酶γ(Polγ)表达的变化。用ELISA法检测DNA内8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平。结果:随着鼠龄的增长,大鼠心肌组织中核DNA(nDNA)损伤不明显,线粒体DNA(mtDNA)损伤严重,DNA内8-OHdG的水平增加,Polγ的表达下降。结论:随着鼠龄的增长,大鼠心肌组织中DNA修复酶Polγ的表达下降,mtDNA损伤增加。DNA损伤与DNA修复能力下降间会引起恶性循环,最终可导致DNA损伤的增加加快心脏衰老。     

沙眼衣原体T3SS效应蛋白CT622的表达与多克隆抗体制备以及对HeLa细胞增殖的影响北大核心CSCD

目的原核表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)CT622蛋白,制备CT622多克隆抗体,初步探讨CT622蛋白对HeLa细胞增殖的影响,为进一步阐明CT622蛋白在沙眼衣原体致病中的作用提供实验依据。方法以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载体pGEX-6p-1/CT622;重组载体经IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST-CT622融合蛋白,PreScission Protease酶切除GST标签后获取纯化的CT622蛋白;将纯化的CT622蛋白去内毒素处理后,经皮下免疫新西兰兔获取抗CT622抗体,采用抗原亲和纯化层析柱进行抗体纯化,BCA测定抗体浓度,SDS-PAGE鉴定多克隆抗体纯度,ELISA检测抗体效价;用不同浓度的CT622蛋白处理HeLa细胞24 h,CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞存活率(%)。结果成功表达并纯化了CT622蛋白,该蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度0.8 mol/L,30℃、180 r/min条件下诱导4 h。制备兔源性抗CT622多克隆抗体,纯化后抗CT622抗体浓度为0.75 mg/ml,纯度>70%,ELISA检测免疫兔血清抗体效价为1∶512000左右;经1~15μg/ml浓度梯度的CT622蛋白处理HeLa细胞后,其细胞存活率高于对照组。结论成功表达、纯化了沙眼衣原体CT622蛋白,制备了高效价兔源性抗CT622抗体。在一定浓度范围内,CT622蛋白能促进HeLa细胞的增殖。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白基因原核表达产物的纯化

目的建立日本血吸虫线粒体相关蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物.方法菌体经冻融、超声破菌及提取包涵体后,用分子筛层析纯化蛋白质并使之复性,再用Western-blot方法对纯化蛋白的抗原性进行分析.经动物免疫后采用dot-ELISA方法检测兔血清中抗体滴度,分析纯化蛋白的抗原活性.结果经分子筛纯化后的融合蛋白rSj338/26GST经SDS-PAGE电泳鉴定达电泳纯,Westernblot显示纯化蛋白能够被日本血吸虫重感染兔血清及rSj338/26GST免疫兔血清识别.dot-ELISA法检测结果表明经分子筛纯化并复性的rSj338/26GST融合蛋白免疫兔血清中特异性抗体的滴度最高,为1∶51200.结论纯化后的融合蛋白rSj338/26GST具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为日本血吸虫病疫苗候选分子进一步深入研究.     

心型脂肪酸结合蛋白的分离纯化和鉴定

目的建立一种心型脂肪酸结合蛋白新的纯化方案。方法以牛心为材料，通过凝胶过滤层析，疏水层析，离子交换层析，快速分离纯化出脂肪酸结合蛋白。结果经SDS-PAGE和Western bbt鉴定，纯度及特异性均良好。并用其免疫大耳白兔获得抗脂肪酸结合蛋白的多克隆抗体。结论该纯化方案可作为一般蛋白的纯化战略。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因原核表达及活性鉴定

目的:构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的原核表达质粒,诱导sTNFR1-MBP融合蛋白表达,观察表达产物的生物学活性.方法:以HeLa细胞的总RNA为模板.用RT- PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1,以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行序列分析和Western blot鉴定.MTT法测定重组蛋白的生物学活性的测定.结果:经DNA序列分析和Western blot鉴定,成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌;在IPTG的诱导下,重组质粒菌能表达sTNFR1- MBP融合蛋白,SDS-PAGE显示在66 kDa处有一特异性表达条带;纯化的sTNFR1-MBP融合蛋白经Western blot证实具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示可有效地封闭TNF-α对OSG7701的细胞毒性作用,随着重组蛋白浓度的增高(0.2,2,20,40,80 mg/L),对TNF-α细胞毒效应的抑制作用增强,细胞死亡率依次为69.98%±1.52%,60.05%±2.18%,46.27%±2.48%,37.02%±3.17%,1.83%±0.59%,1.71%±0.61%.结论:成功获得了具有生物学活性的人sTNFR1-MBP融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

日本血吸虫线粒体相关蛋白基因原核表达产物的纯化

目的 建立日本血吸虫线粒体相关蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物。方法 菌体经冻融、超声破菌及提取包涵体后,用分子筛层析纯化蛋白质并使之复性,再用Western-blot方法对纯化蛋白的抗原性进行分析。经动物免疫后采用dot-ELISA方法检测兔血清中抗体滴度,分析纯化蛋白的抗源活性。结果 经分子筛纯化后的融合蛋白rSj338/26GST经SDS－PAGE电泳鉴定达电泳纯,Western blot显示纯化蛋白能够被日本血吸早重感染兔血清及rSj338/26GST免疫兔血清识别。dot-ELISA法检测结果表明经分子筛纯化并复性的rSj338/26GST融合蛋白免疫兔血清中特异性抗体的滴度最高,为1：51200。结论 纯化后的融合蛋白rSj338/26GST具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为日本血吸虫病疫苗候选分子进一步深入研究。