乳腺导管内增生性病变及乳腺浸润性导管癌中TRβ1基因甲基化的研究

目的：了解乳腺浸润性导管癌及乳腺导管增生性病变组织甲状腺素受体β1（thyroid hormone receptor β1,TRβ1）基因启动子区甲基化状态,探讨其与乳腺癌发生的关系。方法：采用甲基化特异性PCR（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）技术,研究40例乳腺浸润性导管癌（infiltrating ductal carcinoma,IDC）、12例普通型导管增生（usual ductal hyperplasia,UDH）、8例乳腺不典型性导管增生（atpical ductal hyperplasia,ADH）,24例导管原位癌（duetal carcinoma in situ,DCIS）组织及10例健康成人女性乳腺组织中TRβ1基因启动子区甲基化状态。结果：正常乳腺组织、UDH、ADH、DCIS和IDC中,TRβ1基因甲基化率分别为0.0%（0/10）、16.7%（2/12）、37.5%（3/8）、62.5%（15/24）和80.0%（32/40）,正常组织TRβ1基因甲基化率与DCIS和IDC相比差异有统计学意义（P正常组对DCIS=0.001,P正常组对IDC=0.000）;UDH与DCIS相比,差异无统计学意义（P=0.009）;UDH与IDC相比差异有统计学意义（P=0.000）。结论：TRβ1基因启动子区CpG岛甲基化是乳腺癌发生过程中的早期事件,可能在乳腺癌发生和乳腺增生病癌变过程中起重要生物学作用。     

乳腺导管内增生性病变及乳腺浸润性导管癌中TRβ1基因甲基化的研究

目的:了解乳腺浸润性导管癌及乳腺导管增生性病变组织甲状腺素受体β1(thyroid hormone receptorβ1,TRβ1)基因启动子区甲基化状态,探讨其与乳腺癌发生的关系。方法:采用甲基化特异性PCR(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)技术,研究40例乳腺浸润性导管癌(infiltrating ductal carcinoma,IDC)、12例普通型导管增生(usual ductal hyperplasia,UDH)、8例乳腺不典型性导管增生(atpical ductal hyperplasia,ADH),24例导管原位癌(duetal carcinoma in situ,DCIS)组织及10例健康成人女性乳腺组织中TRβ1基因启动子区甲基化状态。结果:正常乳腺组织、UDH、ADH、DCIS和IDC中,TRβ1基因甲基化率分别为0.0%(0/10)、16.7%(2/12)、37.5%(3/8)、62.5%(15/24)和80.0%(32/40),正常组织TRβ1基因甲基化率与DCIS和IDC相比差异有统计学意义(P正常组对DCIS=0.001,P正常组对IDC=0.000);UDH与DCIS相比,差异无统计学意义(P=0.009);UDH与IDC相比差异有统计学意义(P=0.000)。结论:TRβ1基因启动子区CpG岛甲基化是乳腺癌发生过程中的早期事件,可能在乳腺癌发生和乳腺增生病癌变过程中起重要生物学作用。     

Notch1基因单核苷酸多态性与乳腺癌和增生性病变的相关性研究

目的：探讨Notch1基因单核苷酸多态性位点rs3124591与乳腺浸润性导管癌及乳腺导管内增生性病变的相关性。方法：采用MALDI-TOF MS方法对乳腺浸润性导管癌（IDC,n=100）、乳腺导管原位癌（DCIS,n=50）、乳腺普通型导管增生症（UDH,n=100）、以及乳腺癌旁非癌组织（BH,n=100）进行Notch1基因多态性的检测。结果：Notch1基因rs3124591位点基因型和等位基因频率在乳腺4组不同病变中均无显著性差异（P〉0.05）,并且与乳腺癌患者患病年龄、TNM分期、分化程度、转移程度等病理学特征无显著性差异（P〉0.05）,基因型频率在ER、PR（＋）患者分布频率分别为23.4%、2.1%、4.3%,在ER、PR（-）患者分布频率分别为41.5%、23.4%、5.3%,分布频率在ER、PR（＋）〈ER、PR（-）,两者之间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：在乳腺4组不同病变中存在Notch1基因多态性,但与乳腺浸润性导管癌发生发展无关联,这表明原癌基因Notch1的低甲基化可能是导致其蛋白表达改变的原因,这在乳腺癌的发生和发展中可能具有重要意义。     

乳腺癌及癌旁组织中PTEN基因5’CpG岛甲基化状态研究

目的：检测乳腺癌及癌旁组织中PTEN基因5’端CpG岛启动子区域的甲基化状况。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation-specific PCR,MSP）方法对乳腺癌及癌旁组织中PTEN基因5’端CpG岛启动子区域甲基化状况进行研究。结果：乳腺肿瘤组织中PTEN基因甲基化率为31.5%（29/92）,显著高于癌旁组织和正常组织（P〈0.05）,而癌旁组织和正常乳腺组织中甲基化率均比较低,分别为8.3%（2/24）、6.2%（1/16）,两者差异无统计学意义（P〉0.05）;PTEN基因甲基化与肿瘤组织学类型、年龄及肿瘤大小均无相关性,但与淋巴结转移相关（P〈0.05）,淋巴结转移组PTEN基因甲基化率显著高于无淋巴结转移组。结论：PTEN基因5’端CpG岛启动子区域甲基化可能是散发性乳腺癌PTEN基因失活的主要机制,参与了乳腺癌的发生发展过程;PTEN基因甲基化可能是乳腺癌发生发展过程中的晚期事件,提示可以考虑将PTEN基因甲基化作为评价乳腺癌肿瘤细胞转移潜能的分子标记。     

p57KIP2在乳腺浸润性导管癌中的表达及与临床病理特征的关系

目的研究p^57KIP2在乳腺浸润性导管癌（invasive duct carcinoma,IDC）中的表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学S-P法检测64例IDC、15例乳腺导管内癌（ductal carcinoma in situ,DCIS）、15例乳腺良性病变和15例癌旁正常乳腺组织中p^57KIP2蛋白的表达。结果IDC、DCIS、乳腺良性病变及癌旁正常乳腺组织中p^57KIP2蛋白阳性表达率分别为34.38%（22/64）、66.67%（10/15）、80.00%（12/15）、86.67%（13/15）,在IDC与DCIS、IDC与乳腺良性病变、IDC与癌旁正常乳腺组织之间的阳性表达率差异均有显著性（P〈0.01）。在IDC中,p^57KIP2蛋白的阳性表达率与淋巴结转移有关（P〈0.01）,但与淋巴结转移阳性数目多少、组织学分级、肿块大小、患者年龄无关（P〉0.05）。结论本研究显示,p^57KIP2基因参与了乳腺癌的发生发展过程。在乳腺癌组织中,p^57KIP2蛋白低表达可能是乳腺组织恶性转变以及乳腺癌发生淋巴结转移的重要生物学标志。     

乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

目的：检测乳腺癌雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）基因启动子区CpG岛甲基化状态,探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达,同时运用甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高（P〈0.05）;ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高（P〈0.05）。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关,后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。     

乳腺癌及良性病变中P16蛋白与基因5'CpG岛甲基化的病理意义的探讨

目的：探讨P16蛋白在乳腺良生病变,乳腺导管内癌,浸润性导管癌中的表达,p16基因5＇CpG岛甲基化在原发性乳腺癌组织中与P16蛋白失表达的关系及意义.方法：用限制性酶PCR检测45例乳腺浸润性导管癌及15例乳腺良性病变p16基因中5＇CpG岛甲基化状态,甲基化检测结果与免疫组织化学方法检测的P16蛋白表达结果进行比较.结果：p16蛋白在乳腺癌中强表达,但随组织学分级升高,淋巴结的转移,肿瘤直径的增加,p16蛋白表达率降低.p16基因甲基化与p16蛋白表达负相关,且与组织学分级相关.结论：p16基因甲基化是其失表达的可能机制之一.     

Claudin-1在乳腺良性上皮增生及乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨Claudin-1在乳腺癌发生发展中的作用及其诊断价值。方法用免疫组化sP法检测22例普通型导管增生（UDH）、19例非典型性导管增生（ADH）、15例乳腺导管原位癌（DCIS）、12例无淋巴结转移的浸润性导管癌（IDC）、16例有淋巴结转移的IDC组织中Claudin-1的表达情况。结果Claudin-1主要表达于乳腺上皮细胞,表达模式为细胞膜／浆型;与UDH组和ADH组比较,Claudin-1在DCIS和无淋巴结转移及有淋巴结转移的IDC组中的表达显著降低或消失（P〈0．01）。结论在普通型导管增生-非典型性导管增生-乳腺癌的发生发展过程中,Claudin-1的表达逐渐减弱并消失;Claudin-1可用于乳腺良性上皮增生与乳腺癌的鉴别,但不能用于区别UDH和ADH;Claudin-1可作为乳腺癌诊断的一种标记物。     

BRCA1基因在散发性乳腺癌中的表达及异常甲基化

目的：通过检测乳腺癌易感基因1（BRCA1）基因在散发性乳腺癌中的表达情况及其启动子甲基化状态,探讨BRCA1基因与散发性乳腺癌的关系。方法应用实时荧光定量PCR的方法和免疫组织化学方法分别检测BRCA1 mRNA和蛋白在60例散发性乳腺癌组织、癌旁正常乳腺组织及30例乳腺良性病变组织中的表达情况;应用重亚硫酸盐测序PCR（BPS）联合TA克隆测序方法检测上述组织中BRCA1启动子CpG岛的甲基化状态,分析BRCA1基因表达和启动子甲基化相关性。结果BRCA1 mRNA和蛋白在散发性乳腺癌组织中的相对表达水平分别低于癌旁正常组织及乳腺良性病变组织,差异有统计学意义（P＜0．001）。乳腺癌组织中BRCA1蛋白的表达率为51．7％（31／60）,明显低于癌旁正常乳腺组织的71．7％（43／60）及乳腺良性病变组织的66．7％（20／30）,差异有统计学意义（P＜0．001）;散发性乳腺癌组织中BRCA1启动子甲基化率为31．7％（19／60）,癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织均未检测出甲基化,差异有统计学意义（P＝0．000）;BRCA1蛋白表达与其启动子甲基化呈负相关（r＝－0．345,P＝0．007）。结论乳腺癌易感基因BRCA1启动子区CpG岛甲基化导致BRCA1基因表达显著下调,可能参与散发性乳腺癌的发生、发展。     

Beclin 1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达

目的：探讨Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义。方法：免疫组织化学EnVision 法、RT-PCR法和Western blot 法检测50例乳腺浸润性导管癌及相应癌旁组织Beclin 1表达,分析其临床意义。结果：三种方法联合检测发现癌组织中Beclin 1阳性率低于癌旁组织,癌组织中Beclin 1相对表达量也低于癌旁组织;癌组织中Beclin 1表达与患者病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关（P＜0．05）,与患者年龄、绝经状况及乳头侵犯状况无关（P＞0．05）。结论：Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中存在缺失表达或低表达,并与乳腺癌的发生、发展相关。     

甲状腺乳头状癌与基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化的关系研究

目的 研究基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化水平与甲状腺乳头状癌发生的内在联系,建立基于启动子高甲基化抑癌基因的甲状腺乳头状癌早期诊断方法 。方法 收集甲状腺手术切除的组织标本共46例,其中甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）29例,结节性甲状腺肿（nodular goiter）17例。经提取DNA,设计并合成BSP引物,PCR扩增,采用亚硫酸氢盐法克隆测序（bisulfite sequencing）和Sequenom Mass ARRAY甲基化DNA定量分析法检测甲状腺乳头状癌组织TIMP3基因启动子CpG片段的甲基化水平。结果 亚硫酸盐修饰测序结果 显示TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织中的高甲基化克隆百分比为70％,显著高于结节性甲状腺肿的0％（P〈0．05）。TIMP3基因启动子区5个CpG位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化有呈较高的甲状腺乳头状癌特异性。Sequenom Mass ARRAY提供的单一CpG位点甲基化定量数据显示TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织的甲基化率均值（0．28）高于结节性甲状腺肿的甲基化率均值（0．15）,差异有统计学意义（P〈0．05）。TIMP3基因启动子3个CpG位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化率均值高于结节性甲状腺肿甲基化率,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 TIMP3基因CpG-16及CpG-17位点可能为甲状腺乳头状癌的启动子甲基化检测的关键位点,有望成为甲状腺癌早期诊断的分子标志物。     

乳腺癌组织ABCG2基因启动子区甲基化状况与其表达

目的研究多药耐药基因ABCG2启动子区甲基化状态与其在乳腺癌组织中表达的关系，探讨ABCG2基因表达的表观遗传学机制。方法采用甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR，MSP）检测15例乳腺癌组织及配对癌旁组织中ABCG2启动子区-359--353两特异位点的甲基化情况，并经MSP产物测序检测位点的甲基化状态；用Q—PCR检测ABCG2基因mRNA的表达水平；并应用统计学Spearman等级相关性方法分析二者的相关关系。结果15例乳腺癌组织中有13例（86．67％）ABCG2基因启动子区的特异位点存在高甲基化（P〈0．05），MSP产物的测序验证了特异位点的甲基化，并且mRNA表达水平相对增高，二者之间存在显著正相关性（Х^2=0．6842，P〈0．05）。结论ABCG2基因的启动子区-359～-353位点存在高甲基化，可促进该基因在乳腺癌组织中的表达。     

乳腺浸润性导管癌衰减超声征象与病理组织学分级相关性研究

目的：探讨乳腺浸润性导管癌（Infiltrating Ductal Carcinoma,IDC）后方回声衰减超声征象与纤维组织/癌细胞（Fibrous/Cellular,F/C）比值、组织学分级之间的相关性,评价依据后方回声衰减超声征象预测组织学分级的临床价值。方法：回顾性分析经手术病理证实的乳腺IDC患者110例二维超声声像。记录病灶大小、超声形态、有无微小钙化、后方回声增强、后方回声衰减度及超声诊断结果。进行IDC后方回声衰减度与F/C比值、组织学分级相关性分析。结果：在IDC 110例患者中病变直径0.7-4.0 cm,平均（2.36±0.82）cm。病灶后方回声增强7例,后方回声衰减103例,其中衰减Ⅰ度48例、Ⅱ度36例、Ⅲ度19例。IDC组织学分级：Ⅰ级29例;Ⅱ级66例;Ⅲ级15例。F/C比值：（＋）61例;（＋＋）38例;（＋＋＋）11例。IDC病灶后方回声衰减度与F/C比值呈正相关（rs=0.149,P=0.134）,与组织学分级呈负相关（rs=-0.179,P=0.077）,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：IDC后方回声衰减度与病灶病理组织成分相关;IDC病灶后方回声衰减度对组织学分级有一定程度的提示作用。     

Caspase-9在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨半胱氨酸天门冬氨酸特异的蛋白酶9（Caspase-9）在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系。方法：采用免疫组织化学SP方法研究38例乳腺浸润性导管癌（breast infiltrating ductal carcinoma,IDC）、32例乳腺纤维腺瘤及其肿物旁的正常乳腺组织中Caspase-9的表达水平,观察评估Caspase-9的阳性表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理因素的相关性,并探讨与乳腺浸润性导管癌的临床分期、组织学分级的关系。结果：乳腺浸润性导管癌、乳腺纤维腺瘤组织中的Caspase-9的阳性表达均低于正常乳腺组织（P〈0.05）,且乳腺浸润性导管癌明显低度表达（P〈0.01）。其表达水平与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移等不相关（P〉0.05）,与临床分期、组织学分级明显负相关（P〈0.01）。结论：Caspase-9低表达与乳腺浸润性导管癌的恶化显著相关,该指标有助于乳腺浸润性导管癌的预后判断,其可能成为潜在乳腺肿瘤标志物,并成为治疗的靶点。     

Clusterin、Livin、Caspase-3蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达

目的:探讨细胞凋亡相关因子Clusterin、Livin、Caspase-3在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学SP法检测70例乳腺浸润性导管癌、20例乳腺增生和10例乳腺癌旁组织(距癌组织≥4cm,组织学结构正常)标本中Clusterin、Livin、Caspase-3的表达情况,探讨三者的相关性及其与乳腺癌各临床病理学参数间的关系。结果:Clusterin、Livin蛋白在癌组织中的阳性表达率分别为71.4%和64.3%,均明显高于乳腺增生和乳腺癌旁组织的20%、25%(P<0.05)和0%、10%(P<0.05),且Clusterin蛋白与Livin蛋白表达呈正相关(P<0.05)。Caspase-3蛋白在癌组织中的阳性表达率为45.7%,明显低于乳腺增生和乳腺癌旁组织中的75%和80%(P<0.05),且Clusterin、Livin蛋白与Caspase-3蛋白表达呈负相关(P<0.05)。Clusterin蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达随着临床分期的增加阳性表达率显著升高且与组织学分级及淋巴结转移情况有关(P<0.05),与患者年龄、肿瘤大小无关(P>0.05),而Livin蛋白的阳性表达率随着临床分期增加显著升高(P<0.05),但与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移无关(P>0.05),Caspase-3蛋白的表达随着临床分期的增加其阳性表达率下降(P<0.05),与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级和淋巴结转移无相关性(P>0.05)。在乳腺浸润性导管癌组织中Clusterin、Livin蛋白与ER、PR的表达负相关(P<0.05),与C-erbB-2的表达无相关性(P>0.05),Caspase-3蛋白与ER、PR表达显著正相关(P<0.05),与C-erbB-2表达无相关性(P>0.05)。结论:Clusterin、Livin可能通过抑制细胞凋亡在乳腺癌的发生发展中发挥重要促进作用,二者可能成为乳腺浸润性导管癌诊断的重要标志物和评估预后的潜在指标;Clusterin与Livin的联合靶向治疗,有望成为乳腺浸润性导管癌治疗的新方法。Caspase-3在Clusterin、Livin抗凋亡通路中发挥着重要作用。     

CK5/6、p63在乳腺良恶性病变鉴别诊断中的意义

目的:探讨CK5/6、p63标记在乳腺良恶性疾病中的表达及意义。方法:根据WHO(2003)乳腺肿瘤分类标准收集乳腺普通型增生(UDH),非典型增生(ADH),原位癌(DC IS)和浸润性导管癌(IDC)标本各12例。应用免疫组化进行CK5/6、p63检测,观察其在不同类型病变乳腺组织中的分布及表达水平。结果:在UDH中,CK5/6阳性的细胞主要分布于肌上皮和腔内的腺上皮,腺腔中的阳性细胞排列呈马赛克状;p63主要表达于导管周围的肌上皮;两种标志物均呈中-重度阳性着色。在ADH中,CK5/6阳性细胞主要分布于肌上皮,腺腔内仅见少许腺上皮呈阳性着色;p63主要表达于导管周围的肌上皮;相比UDH而言,CK5/6和p63的阳性表达率明显减低。在DC IS中,肌上皮CK5/6仅呈轻-中度阳性着色,而腺腔内腺上皮未见明显着色,p63主要表达于导管周围的肌上皮。与ADH相比而言,CK5/6的表达水平明显减低,但p63的阳性表达率未见明显变化。在IDC中,仅1例肿瘤细胞CK5/6呈阳性着色,另外1例肿瘤间质中可见少许p63阳性表达细胞。结论:联合运用CK5/6、p63可鉴别UDH,ADH,DC IS和IDC。     

乳腺导管内增生性病变p35外显子突变的研究

 目的肿瘤抑制基因突变是浸润性乳腺癌发生发展中常见事件,而其与包括普通型增生（UDH）,不典型增生（ADH）及导管内原位癌（DCIS）的乳腺导管内增生性病变关系不明。探讨在乳腺导管内增生性病变的外显子突变情况,以期了解突变在乳腺癌发生发展中的作用。方法用高分辨率熔解曲线和测序研究122 例乳腺导管内增生性病变中外显子5~8 的突变情况。结果经HRM筛选,14 例患者DNA熔解曲线与野生型标准品熔解曲线大于阈值,经测序分析,其中13例出现外显子突变。35例UDH 中均未发现突变,10.7%（6/56）ADH 和22.6%（7/31）DCIS 发现至少1 个位点的点突变,其中1 例DCIS 发现2 个位点的突变。结论突变发生于乳腺导管内增生性病变中的ADH与DCIS,其可能为乳腺癌发生发展中的早期事件。     

STAT3基因与MMP-2、MMP-9在乳腺浸润性导管癌中的表达及其相互关系

目的磷酸化信号传导与转录激活因子3蛋白与乳腺浸润性导管癌中上皮间质转化(EMT)关系密切,EMT需要降解细胞外基质(ECM),而基质金属蛋白酶(MMPs)是降解ECM和基底膜(BM)的主要执行者。本研究从EMT角度探讨磷酸化信号传导与转录激活因子3(STAT3)基因与MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义。方法应用RT-PCR技术检测30例新鲜乳腺癌及癌旁组织标本的STAT3基因的表达,并以免疫组化方法检测70例乳腺浸润性导管癌组织中pSTAT3、MMP-2和MMP-9的表达,分析pSTAT3蛋白与MMP-2、MMP-9表达的关系及其与临床病理参数的关系。结果 STAT3mRNA在乳腺癌标本中相对浓度为0.526±0.312,癌旁组织为0.197±0.161,两组间有显著统计学差异(P<0.05);pSTAT3、MMP-2、MMP-9在乳腺浸润性导管癌中阳性表达率分别为62.9%、72.8%、67.1%,明显高于正常乳腺组织19.2%、26.9%、34.6%,具有显著统计学差异(P均<0.05)。MMP-2、MMP-9在不同年龄、肿瘤大小、ER、PR表达组之间比较,差异无统计学意义,而在不同组织学分级、有无淋巴结转移之间,MMP-2、MMP-9表达有显著差异(P均<0.05)。结论 STAT3基因及pSTAT3与MMP-2、MMP-9表达在乳腺癌中呈正相关,STAT3基因及pSTAT3和MMP-2、MMP-9的高表达与乳腺癌的组织学分级与淋巴结转移相关,STAT3基因可能通过调节MMP-2、MMP-9的表达介导EMT从而促进乳腺浸润性导管癌的侵袭转移。