原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

酵母质粒PCR扩增及酶切在酵母双杂交中的运用

目的:减少对初步筛选获得的阳性克隆进一步鉴定的工作量,防止阳性克隆的丢失.方法:提取酵母双杂交筛选cDNA表达文库获得的阳性克隆酵母细胞质粒,以文库载体插入片段两端特异序列为引物,PCR扩增插入片段,限制性核酸内切酶酶切扩增产物,琼脂糖凝胶电泳,根据带型对阳性克隆进行分类.结果:将初步获得的107株阳性克隆,分为24类,在PCR扩增过程中发现个别克隆含有两种以上的文库质粒.结论:酵母质粒PCR扩增,酶切分类的方法,不仅可以大大减轻阳性克隆进一步鉴定的工作量,避免不必要的浪费,而且还可以避免阳性克隆的丢失.     

阴道毛滴虫衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶基因克隆和蛋白表达

目的:克隆并分析阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis,Tv)衰老生物学标志分子β-半乳糖苷酶(β-gal)同源基因,表达β-GAL重组蛋白。方法:从Tv cDNA表达文库中分离获得Tv β-gal同源基因的cDNA克隆,测序和序列分析。将cDNA部分片段亚克隆到原核表达载体(pQE-80L),转化宿主菌E.coli SG13009,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定。结果:在Tv cDNA文库中获得1株2445 bp的cDNA克隆。序列分析表明,该序列开放读码框有2415 bp,推测肽链具有804个氨基酸,等电点为5.4;该肽链与多种来源的β-GAL同源蛋白均具有较高同源性。用PCR扩增了该cDNA序列中的2277 bp片段,构建了pQE-80L/Tv β-gal,所表达重组蛋白产物的相对分子质量为82 ku。结论:推测该克隆是Tv β-gal的同源基因,Tv β-gal基因可以在E.coli中得到表达,为进一步研究其细胞内定位和蛋白功能奠定了基础。     

视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库的鉴定与分析

目的:对构建的猫视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库进行初步克隆、鉴定和分析.方法:用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行cDNA文库扩增和蓝白斑筛选,每个文库随机挑取300个白色克隆用菌落PCR进行鉴定.对阳性克隆菌落进行DNA测序以获得差异表达基因片段序列.将测序所得的序列通过互联网用Blast程序查找日本国家DNA数据库进行同源性分析.用实时定量PCR验证差异克隆.结果:PCR鉴定获得1000个阳性菌落,测序获得674个EST片段,序列长度在200～800 bp之间.同源性分析结果提示4周正向文库得到14个同源基因,4周反向文库得到20个同源基因,8周正向文库得到23个同源基因,8周反向文库得到19个同源基因.这些基因可归类于能量代谢、物质转运、信号转导、基因转录、细胞损伤与修复、MHC分子等.实时定量PCR检测的4个克隆证实是差异表达序列.结论:本研究构建的视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库为进一步鉴定和研究慢性视神经损伤相关基因提供了实验基础.     

铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析

构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库,为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR(long distance polymerase chain reaction)法反转录合成双链cDNA,以λTripIEX2为载体,构建铁皮石斛cDNA文库,文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位 (pfu)的数目来表示,PCR扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库,原始文库的噬菌斑滴度为 4．3×105pfu/mL,总克隆数为3．1×105,重组率为97．6％,扩增后文库总滴度为6．8×109 pfu／mL,对随机挑取的噬菌斑进行 PCR鉴定,结果插入片段多分布在0．5～2．0kb之间,绝大部分在1．2～1．7 kb左右。【结论】文库质量鉴定结果表明,所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。     

紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选血吸虫成虫cDNA文库

目的 :寻找照射致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子 ,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法 :用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库 ,并对阳性克隆的插入基因片段进行PCR扩增及测序分析。结果 :经三轮筛选 ,获 10个阳性克隆 ,其插入的SjcDNA片段大小为 1 5～1.8kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中 2个序列分别与Sj动力蛋白轻链 5 (DLC 5 )及Sj线粒体基因明显同源 ,其余 3个序列为未知的新基因片段。结论 :获得的阳性克隆插入基因片段可能为编码抗日本血吸虫感染的抗原基因     

从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原

目的 从葎草花粉cDNA表达文库中筛选过敏性哮喘特异性变应原.方法 应用葎草花粉过敏性哮喘患者血清对自行构建的葎草花粉cDNA λTripIEx2噬菌体表达文库进行免疫学筛选,提取阳性噬菌体DNA,EeoR I和HindⅢ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行DNA序列测定、重复序列分析和同源性分析.结果 经过3轮筛选,从cDNA表达文库中筛选获得3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆,其序列大小分别为868、550和592 bp.测序结果表明这3个克隆代表3个不同的cDNA序列,重复序列分析未发现重复序列,同源性分析表明与现有的基因均无高度同源性.结论 所获得的与过敏性哮喘相关的3个葎草花粉特异性变应原cDNA克隆可能为新基因,此发现为进一步制备重组变应原疫苗或核酸疫苗打下了良好基础.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。