钙载体A_(23187)快速诱导人外周血单核细胞成树突状细胞

 目的　探讨钙载体 (calciumionophore ,CI)A2 3 187对正常人外周血单核细胞来源的树突状细胞(Dendriticcell,DC)形态、表面分子表达及免疫功能的影响。方法　分离健康献血者外周血单核细胞 ,分别加入 :重组人粒 /单集落刺激因子 (rhGM CSF) 10 0ng/ml、rhGM CSF 10 0ng/ml +IL 4 5 0ng/ml、rhGM CSF +A2 3 187(钙载体 ,CI)各 10 0ng/ml。体外培养 4 0h后 ,于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志、MTT比色法检测上述细胞对同种异体T细胞的刺激增殖作用。结果　外周血单核细胞在GM CSF +A2 3 187各 10 0ng/ml的条件下培养 4 0h ,就可看到典型的DC形态 ,其表面单核细胞的特征性标志CD14分子表达减少 ,HLA DR、CD80、CD86及CD83分子的表达均明显增高 ,且具有明显刺激同种异体T细胞增殖的能力。结论　外周血单核细胞在钙载体A2 3 187及GM CSF的共同作用下 ,4 0h就能获得成熟的DC     

人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

连续贴壁法分离培养人外周血来源树突状细胞及其超微结构的观察

目的改进人外周血单个核细胞分离培养树突状细胞的方法,电镜观察树突状细胞超微结构。方法利用连续贴壁法分离获得CD14 前体细胞,经人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导产生成熟DC,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,透射电镜(TEM)观察树突状细胞超微结构。结果连续贴壁法体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离培养的DC。培养1周的DC高表达CD1a、CD40、HLA-DR、CD80、CD86。透射电镜观察到不同状态树突状细胞的超微结构。结论连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源DC。     

人外周血树突状细胞诱导及免疫学特性研究

[目的]从人外周血分离、纯化、扩增树突状细胞(DC),并对其形态学和免疫学特性进行初步探讨.[方法]从人外周血分离DC前体细胞(主要为CD14 细胞)用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增成熟DC.观察DC形态、分析DC表型、核型及检测DC激发同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]分离的DC前体经rhGM-CSF和rhIL-4共同培养1周后,可获得大量成熟DC,扩增了24.5倍,纯度达90%以上.DC高表达分化抗原CD86、CD40、HLA-DR、CD83、CDIa,能强烈激活同种异体T淋巴细胞增殖.[结论]人外周血CD14 细胞经体外诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,从而为进一步开展DC的基础研究和临床应用打下基础.     

人急性早幼粒细胞性白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的体外研究

树突状细胞(dendritic cells,DC)在激发机体抗白血病T细胞免疫应答中具有重要作用,有报道DC可以由单核细胞及粒细胞分化生成,本研究应用细胞因子在体外诱导了急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞向DC的分化.从M3型APL患者外周血分离白血病细胞,加入GM-CSF(100ng/ml)或GM-CSF(100ng/ml) rhIL-4(500U/ml)体外培养14天,并于培养结束前3天加人TN-α(100ng/ml).结果表明,GM-CSF可以促进白血病细胞体外增殖,并从幼稚状态逐渐分化成熟,表达高水平的CD45分子,其中部分为CD14~ 的单核细胞,部分为CDla~ 的DC(M3DC);培养后期加入TNF-α,可以促进DC生成,约占35%;以GM-CSF IL-4培养也诱导了幼稚细胞的成熟,2周后DC约占10%,但较少单核细胞生成,培养至3周时DC约占60%;而在培养后第11天加入TNF-α则可以加速DC生成,3天后生成的白血病型DC达90%.电镜观察到M3DC具有与单核细胞来源的DC相似的超微结构,但具有的突出特征是部分细胞存在少量胞浆颗粒;M3DC高表达HLA-DR、B7-2、CD40、CD54分子,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖.此类由白血病细胞诱导生成的DC可被用于体内外诱导生成肿瘤特异性CTL,在APL的免疫治疗中具有一定的应用价值.     

GM-CSF重组腺病毒转染外周血树突状细胞的研究

目的:利用GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,诱导培养树突状细胞(dendriticcell,DC),并与细胞因子培养的DC进行生物学特性的比较。方法:将GMCSF重组腺病毒转染正常人外周血单核细胞,或用重组细胞因子GMCSF,诱导培养获得DC,通过相差显微镜观察DC表面形态变化,FACS分析GMCSF基因转染对DC表面免疫分子表达的影响,Westernblot鉴定GMCSF的表达,ELISA检测IL12分泌水平,MTT法检测DC激发同种异体T细胞增殖的能力。结果:GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,能扩增获得DC,该DC高表达CD1a、HLADR、CD80和CD86等免疫分子,并表达细胞因子GMCSF和IL12,对同种异体淋巴细胞有更强的刺激活性。结论:用GMCSF重组腺病毒可从外周血单核细胞中扩增到DC,为DC瘤苗临床应用提供实验基础。     

人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定

目的：建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞(DC)的方法：方法：从正常人外周血F1细胞分离单个核细胞，经三种细胞因子——重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rh GM—CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)和重组人肿瘤坏死因子(rh TNFα)联合诱导培养，10天后收获细胞，利用光学显微镜、透射电镜观察其外部形态和细胞超做结构，流式细胞仪检测其细胞表面抗原，自体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的增殖活性：结果：培养收获了高纯度的DC，这些细胞表面有大量的不规则突起，核也呈不规则状，核仁小，核膜异染色质聚集，含有丰富的细胞器，如核糖体、内质网、溶酶体等；细胞表面高水平表达HLA—DR、CD1α、CD80、CD83和CD86；自体混合淋巴细胞反应表明诱导所得的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单个核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟DC。     

树突状细胞的诱导培养及对胃癌细胞株MKN45的体外杀伤效应的初步研究

目的 探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法及CpG ODN1826刺激DC对胃癌细胞MKN45的杀伤效应.方法 分离正常人外周血DC,培养至第5天,实验分为4组,A组[粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白细胞介素-4(IL-4)]、B组[GM-CSF+IL-4+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、C组(nonCpG ODN)和D组(CpG ODN 1826).自外周血单核细胞(PBMC)诱导分离DC,流式细胞仪检测DC表面标志,MTT法测定其刺激对同种异体淋巴细胞增殖的影响及对胃癌细胞的杀伤效应.结果 体外培养至第10天,D组和B组均出现大量典型的DC形态.倒置显微镜下见细胞呈树突状、伪足状突起.流式细胞仪检测,D组显著高表达共刺激分子(CD40、CD1a、CD80、CD86)和MHC-Ⅱ类分子,均分别高于其他各组(P＜0.05).在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞的增殖,显著增强DC杀伤胃癌细胞MKN45的活性.结论 该培养方法可获得较高纯度典型的DC,同时CpG ODN可显著诱导人外周血DC分化成熟,增强DC对胃癌细胞MKN45的杀伤作用.     

γ-射线诱导胆管癌细胞凋亡致敏树突状细胞后的免疫应答

目的：建立γ-射线诱导癌细胞凋亡致敏从人外周血诱导扩增的树突状细胞（dendritic cells,DCs的方法。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞，加入50ng/ml rhGM-CSF,1000U/ml rhIL-4，隔天1次，共4次，培养第3天，加入γ-射线诱导凋亡的胆管癌细胞，再继续体外培养4天后，用树突细胞富集柱收集DCs。结果：DCs高表达共刺激分子B7和CD1a，表达具有典型不规则突起，γ-射线诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被DC捕捉、吞噬，负载抗原的DCs其激发同种异体T淋巴细胞增殖的能力进一步增强。结论：γ-射线诱导癌细胞凋亡可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单核细胞诱导、扩增出的DCs，DCs可以有效提呈凋亡胆管癌细胞的抗原，可望成为有效的肿瘤抗原致敏DC的新途径。     

含甲胎蛋白肽段的重组腺病毒转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对肝癌细胞的体外杀伤效应

目的 研究人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)转染含甲胎蛋白(AFP,137-145)片段的重组腺相关病毒后所诱导的特异性T细胞对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的体外杀伤作用.方法 抽取健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含AFP片断的重组腺相关病毒转染未成熟DC,诱导特异性T细胞.检测体外培养的DC和细胞毒性T细胞(CTL)活性,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用.结果 转染或未转染的体外培养的成熟DC高表达CD40、CD86和IL12,成熟DC诱导的CTL高表达IFNγ;修饰成熟后的DC后体外能诱导特异性CTL,该CTL在休外对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721均有杀伤作用.结论 重组腺相关病毒转染DC,不明显改变DC表型和刺激淋巴细胞增殖和分化功能,可诱导自体CTL增殖,含AFP(137～145)片断的腺相关病毒转染DC诱导自体CTL对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721细胞有明显杀伤作用,DC疫苗可以作为肝癌患者免疫治疗的有效补充.