无动物源性成分培养体系快速诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化

背景 随着视网膜色素上皮(RPE)细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)研究的开展,需要优化无动物源性成分(xeno-free)培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞(hESCs)向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要. 目的 建立xeno-free培养体系,优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法. 方法 将hESCs克隆团接种至Vitronectin XFTM,在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/ml DKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)培养2d,第2～4天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml,并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),第4～6天移除培养液中的noggin和bFGF,第8～14天培养液中加入1 μmol/L CHIR99021.倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化,免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量.结果 分化培养第14天,部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列,且细胞内可见色素颗粒;培养第35天,诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65;培养至第60天,细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形.与诱导分化前比较,诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了(3.43±2.77)倍和(8.91±2.83)倍,而RPE65 mRNA的表达量分别增加了(14.60±3.94)倍和(87.16±9.32)倍,分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65mRNA的相对表达量均明显高于分化前,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞.     

胚胎干细胞诱导分化视网膜细胞的方法新进展

视网膜变性疾病是引起视力丧失的重要原因,由于这类眼病的病因不明确、发病机制复杂,目前尚无有效的治疗方法.近年来,干细胞研究领域取得了突破性进展,干细胞具有分化为机体所有细胞的潜能,可以利用胚胎干细胞(ESCs)分化出各种视网膜细胞,这为视网膜变性疾病的治疗带来了新的曙光.ESCs治疗视网膜变性疾病至关重要的一步是将ESCs分化为视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮(RPE)样细胞.本文对自发诱导培养法、共培养法、细胞因子诱导法、单层贴壁诱导培养法和3D诱导培养法等ESCs分化为视网膜光感受器细胞和RPE细胞方法的最新进展进行综述.     

视网膜色素上皮细胞的诱导分化及其移植治疗方法的研究进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)的病变可以导致多种视网膜疾病,目前缺乏有效的治疗手段.人类多能干细胞具有多向分化潜能,为此类疾病的细胞治疗提供了理想来源.本文将近年来胚胎干细胞和诱导多能干细胞体外定向分化为RPE细胞及移植治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病的研究进行了综述.     

视网膜色素上皮细胞的诱导分化及其移植治疗方法的研究进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)的病变可以导致多种视网膜疾病,目前缺乏有效的治疗手段.人类多能干细胞具有多向分化潜能,为此类疾病的细胞治疗提供了理想来源.本文将近年来胚胎干细胞和诱导多能干细胞体外定向分化为RPE细胞及移植治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病的研究进行了综述.     

胚胎干细胞在视网膜色素上皮细胞移植中的应用研究

视网膜移植研究的兴起为视网膜变性类疾病的治疗带来希望,由于供体缺乏、移植免疫等问题,视网膜色素上皮(RPE)细胞等的视网膜移植在临床上的应用发展受到阻碍。随着生物科学领域的发展,胚胎干细胞(ESCs)的特征鉴定及体外培养等技术的不断提高,ESCs可在体外诱导分化成RPE细胞,成为视网膜移植一大供体来源。本文就ESCs的体外分离培养、鉴定、诱导分化的研究及其在RPE移植中的应用研究作一综述。     

脂肪干细胞体外诱导获得RPE样细胞及其治疗AMD相关研究进展

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）是一种随年龄增长而发病率逐渐升高的黄斑部疾病.主要由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）和视网膜退行性变引起的不可逆性中心视力下降.人类脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSC）具有多向分化潜能.近年研究发现,ADSC联合视网膜细胞诱导因子可体外诱导ADSC向RPE细胞分化,并表达RPE细胞的标志.相关动物模型显示,由ADSC分化而来的RPE样细胞移植后可参与视网膜重建及修复.ADSC移植为AMD的治疗提供了新思路.     

逆转录病毒感染法对RP患者人体细胞向iPS细胞和iPS-RPE细胞诱导分化的研究

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性(RP)的主要手段.诱导多能干细胞(iPSCs)将成为移植细胞的一个重要来源,人胚胎干细胞(hESCs)可以无限期地自我更新和分化,是RPE细胞移植的重要供体来源.此外,iPS-RPE细胞为患者自身细胞成为治疗源组织提供了个性化治疗平台. 目的 评估利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因导入RP患者皮肤成纤维细胞后诱导人iPSCs的可行性,并建立将正常人iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法. 方法 分别采集基因突变点为SNRNP200 p.S1087L的RP患者及无SNRNP200 p.S1087L突变受试者的大腿皮肤组织块约2 cm×3 cm.采用胰蛋白酶消化和组织块培养法分离纯化得到成纤维细胞并进行传代,取第3代细胞用于研究,分别采用形态学和免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定.采用含OCT4、SOX2、C-MYC和KLF4 4种cDNA的质粒病毒转染的成纤维细胞,并用hESCs条件培养液诱导iPSCs,采用细胞形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、干细胞表面多潜能标志物表达对所得到的iPSCs和iPS-RPE细胞进行鉴定,并通过细胞在SCID小鼠的体内种植考察iPSCs的成瘤性.采用诱导分化拟胚体(EB)法将不含SNRNP200 p.S1087L突变的iPSCs诱导分化为RPE细胞,分别采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR法检测细胞中特异性蛋白的表达.结果 用皮肤组织块培养的成纤维细胞呈梭形和多角形,光学显微镜下可见细胞间排列紧密,细胞形态和大小趋于一致,细胞中特异性蛋白Vimentin表达阳性.经逆病毒转染的成纤维细胞培养后第5～7天可见小的细胞聚集,细胞形态由梭形变为圆形;培养后20d出现类似hESCs集落形态的iPSCs克隆;培养后25 ～ 30 d细胞中的标志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81及Nanog均呈阳性表达,培养后12周形成的iPSCs克隆中AP染色阳性,接种到SCID小鼠体内后形成畸胎瘤.免疫荧光染色显示,诱导分化后30 d时iPS-RPE细胞中RPE细胞特异性标志物RPE65、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)蛋白均呈阳性表达.结论 利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种基因转入SNRNP200 p.S1087L突变的RP患者皮肤成纤维细胞后可以获得iPSCs,建立的iPSCs有ESCs的形态和多能分化的特征.采用同样的转染技术可在无SNRNP200 p.S1087L突变的人皮肤成纤维细胞中建立体外高分化、高效能的iPS-RPE细胞.     

诱导多功能干细胞在视网膜再生医学中的应用

诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）是由4个转录因子与成体细胞基因组进行重组诱导出的一种全能分化型干细胞.多种疾病会导致视网膜的结构或功能受损,可利用iPSC的增生分化能力使视网膜再生.在视网膜再生医学领域,iPSC的研究热点集中在：供体细胞、转录因子及转录载体的选择、诱导分化机制的研究、iPSC向视网膜不同类型细胞分化的诱导途径以及诱导出的视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞的移植方法.但在目前关于iPSC的研究中仍存在定向诱导分化效率较低、眼内移植后存活率低、临床应用安全性难保障等一系列问题.唯有解决上述问题,iPSC研究才能在视网膜再生医学领域发挥更大的作用.     

视网膜修复中干细胞的应用

视网膜疾病由于其不可逆转的致盲性而影响人类生存质量.随着对干细胞研究的深入,基于干细胞移植的细胞替代疗法为视网膜疾病的治疗开辟了新的途径.近年来眼组织来源的视网膜干细胞或祖细胞、非眼组织来源的间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞在视网膜损伤疾病中的应用取得了很多突破性进展,它们不仅可以被诱导分化为各种视网膜神经元细胞、胶质细胞,而且移植到体内可以整合到损伤视网膜,甚至可以发挥正常视网膜神经元细胞功能.     

人视网膜色素上皮细胞替代疗法治疗视网膜退行性疾病

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞替代疗法是治疗视网膜退行性病变的潜在方法。在眼部进行RPE细胞替代治疗有独特优势。替代用RPE细胞可源于干细胞和体细胞。前者包括胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)-RPE及诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)-RPE;后者分为成年人来源(自体或异体)及胎儿来源(Fetal-RPE)。RPE细胞替代治疗的临床研究尚处于早期阶段。目前人ESC-RPE细胞、人iPSC-RPE细胞、人Fetal-RPE细胞治疗视网膜退行性疾病均处于临床前研究及临床研究阶段。临床试验结果显示部分患者视功能改善。但ESC-RPE及Fetal-RPE均无法避免免疫排斥反应,使用免疫抑制剂的并发症亦值得关注,移植细胞能否长期存活尚需进一步观察。iPSC诱导方案、ESC及iPSC分化为RPE细胞的方法也未形成统一、规范的指南,合理的治疗时间窗、细胞植片制作及移植术的改良是保证效果的关键。(国际眼科纵览,2020,44:419-426)     

干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的途径探讨

近年来,干细胞在眼科领域的研究及应用受到高度关注,胚胎干细胞(ES)、成体干细胞能够被定向诱导分化成视网膜色素上皮细胞,由此可获得转分化的大量的视网膜色素上皮细胞源,通过体内干细胞及视网膜色素上皮细胞移植有望应用于各种视网膜退行性疾病的细胞替代治疗。本文就各种干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的途径及应用进行探讨。     

抑制视网膜色素上皮细胞发生上皮-间充质转化的研究进展

视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是增殖性玻璃体视网膜疾病(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的主要发病机制,也是治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)时,造成抗血管内皮生长因子(anti-vascular endothelial growth factor, anti-VEGF)疗效降低的重要因素。除此之外,随着细胞替代治疗作为年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)的新型治疗方式而兴起,人类胚胎干细胞(hESC-RPE)、体细胞诱导多能干细胞(iPSC-RPE)定向诱导分化的RPE细胞以及来自于流产胎儿的胎儿视网膜色素上皮细胞(fetal RPE,fRPE)逐渐受到了研究者们的关注。为了发挥最好的治疗效果,保证治疗用细胞的稳定增殖及高效分化是极其重要的。但是在传代扩增的过程中,由于上皮间充质转化的存在,导致这些细胞出现增殖困难以及再分化能力下降,从而影响治疗效果并阻碍了治疗人群的普及,使细胞替代治疗难以推广。所以,鉴于上皮间充质转化在视网膜疾病的发生和治疗中都造成了重要影响,抑制视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化就显得尤为重要,为此,我们将阻止上皮间充质转化研究的最新进展综述如下。     

微小核糖核酸-204和211在人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化过程的变化

目的 观察人胚胎干细胞（hESC）向视网膜色素上皮（RPE）细胞诱导分化过程中微小核糖核酸（miRNA）-204和211的变化特征。方法 采用自然分化法诱导hESC向RPE细胞分化,细胞鉴定。按细胞诱导分化时间秩序,分为hESC组、含色素细胞组、hESC源性RPE细胞组和原代培养的人胎RPE（hfRPE）细胞组。行miRNA基因表达谱芯片分析、miRNA-204和211实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测。 结果 miRNA芯片分析结果显示,随细胞诱导分化过程, miRNA-204持续上调。其中,含色素细胞组是hESC组的5.026倍,hESC 源性RPE细胞组是含色素细胞组的3.337倍;hfRPE细胞组是hESC源性RPE细胞的13.574倍。miRNA-211在细胞诱导分化过程中上调不明显,但从hESC源性RPE细胞到hfRPE细胞,上调倍数为44.333倍,是miRNA表达谱中差异最大的miRNA。RT-PCR检测结果显示,hESC组、含色素细胞组、hESC源性RPE细胞组、hfRPE细胞组miR-204相对表达量分别为91.81±4.43、2 263.09±206.39、5 996.80±235.42、171 676.45±999.82,差异有统计学意义（t=18.22、20.66、279.38,P＜0.001）;miRNA-211相对表达量分别为2.23±0.31、129.33±3.75、125.76±4.78、16 682.00±352.97。含色素细胞组和hESC细胞组、hfRPE细胞组和hESC源性RPE细胞组miR-211相对表达量比较,差异均有统计学意义（t=58.58、81.24,P＜0.001）。结论 miRNA-204和211在hESC向RPE细胞诱导分化过程中持续单一变化。     

Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation

Inherited maculopathies, age related macular degeneration and some forms of retinitis pigmentosa are associated with impaired function or loss of the retinal pigment epithelium (RPE). Among potential treatments, transplantation approaches are particularly promising. The arrangement of RPE cells in a well-defined tissue layer makes the RPE amenable to cell or tissue sheet transplantation. Different cell sources have been suggested for RPE transplantation but the development of a clinical protocol faces several obstacles. The source should provide a sufficient number of cells to at least recover the macula area. Secondly, cells should be plastic enough to be able to integrate in the host tissue. Tissue sheets should be considered as well, but the substrate on which RPE cells are cultured needs to be carefully evaluated. Immunogenicity can also be an obstacle for effective transplantation as well as tumorigenicity of not fully differentiated cells. Finally, ethical concerns may represent drawbacks when embryo-derived cells are proposed for RPE transplantation. Here we discuss different cell sources that became available in recent years and their different properties. We also present data on a new source of human RPE. We provide a protocol for RPE differentiation of retinal stem cells derived from adult ciliary bodies of post-mortem donors. We show molecular characterization of the in vitro differentiated RPE tissue and demonstrate its functionality based on a phagocytosis assay. This new source may provide tissue for allogenic transplantation based on best matches through histocompatibility testing.     

小分子化合物在干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞中的应用

视网膜色素上皮细胞的变性、坏死将导致患者的视力丧失。由于视网膜色素上皮细胞不能再生,移植健康的视网膜色素上皮细胞已成为视网膜变性性疾病最具有前景的治疗策略。随着化学、分子生物学和再生医学的发展,人们发现越来越多的小分子化合物通过调控某些特定的信号通路,能够操纵干细胞的分化方向。本文主要对小分子化合物在体外诱导干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞的应用作一综述。     

移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠变性性视网膜病变

目的 观察视网膜下腔移植大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)治疗碘酸钠诱发的变性性视网膜病变的效果.方法 Brown-Norway(BN)大鼠120只,分为碘酸钠注射模型组、rMSCs移植治疗模型组、正常对照组,每组各40只大鼠.模型组大鼠通过尾静脉注射碘酸钠建立变性性视网膜病变模型,正常对照组大鼠给予生理盐水注射.通过视网膜眼底照相、荧光素眼底血管造影、视网膜电图(ERG)和组织学方法鉴定视网膜色素上皮(RPE)和神经视网膜损伤,进一步使用原位凋亡检测(TUNEL)的方法对碘酸钠诱导视网膜变性的细胞病理学变化进行观察.原代分离rMSCs后进行流式细胞术鉴定,将CM-DiI荧光染料标记的rMSCs移植到受体动物的视网膜下腔,采用临床检查手段结合组织学检查方法对细胞疗法进行评估.在移植手术后14～60 d,检查rMSCs的存活,整合和分化情况.结果 在碘酸钠注射14 d内,模型组大鼠视网膜的功能逐渐衰竭,呈现时间依赖的关系.模型组大鼠RPE细胞破坏后,光感受器细胞外节出现断裂、缩短的变化直到核同缩.细胞核形态变化和TUNEL标记的结果表明光感受器细胞的死亡主要是凋亡.经过rMSCs移植.供体细胞能够存活并散在分布于视网膜下腔,分化为RPE细胞.ERG检查结果显示,60 d后模型组ERG b波改善率为27.80%,模型组ERG震荡电位(Ops)改善率为59.38%;表明rMSCs移植治疗模型组大鼠视网膜功能得到明显保护.结论 经过rMSCs移植,碘酸钠诱发的视网膜变性可以得到有效地治疗,移植后的rMSCs能够存活,分化为RPE细胞.     

兔眼与猪眼视网膜色素上皮细胞分离及培养方法的对比

目的分别对兔眼及猪眼视网膜色素上皮（RPE）细胞进行体外分离、培养和鉴定,探讨二者的异同点及注意事项。方法对有色兔眼和猪眼的RPE细胞采用胰蛋白酶消化法进行分离、培养和传代,取第4代细胞用于实验。免疫细胞化学染色对传代的细胞进行鉴定。光学显微镜下观察并比较培养的2种动物来源RPE细胞的形态、特征,并对2种动物来源的RPE细胞的培养过程进行比较。结果2种动物来源的RPE细胞分离方法的不同与各自眼球的解剖结构相关,主要体现在消化过程,猪眼RPE细胞1次消化即可分离,兔眼RPE细胞需2次消化得到。原代猪眼RPE细胞24h内贴壁较兔眼48～72h贴壁时间早。培养早期细胞生长活跃,随传代次数增加活力下降,色素颗粒减少。免疫细胞化学染色提示细胞角蛋白（AE1／AE3）表达阳性。结论2种动物来源的RPE细胞均可通过胰蛋白酶消化法分离,获得的RPE细胞数量多,培养成功率高。猪眼RPE细胞的分离培养更为容易。4代以内的RPE细胞适合于实验研究。     

Immunological aspects of RPE cell transplantation

Retinal pigment epithelial (RPE) cells have several functions, including support of the neural retina and choroid in the eye and immunosuppression. Cultured human RPE cells directly suppress inflammatory immune cells. For instance, they directly suppress the activation of T cells in vitro. In contrast, transplanted allogeneic human RPE cells are rejected by bystander immune cells such as T cells in vivo. Recently, human embryonic stem cell-derived RPE cells have been used in several clinical trials, and human induced pluripotent stem cell (iPSC)-RPE cells have also been tested in our clinical study in patients with retinal degeneration. Major safety concerns after stem cell-based transplantation surgery include hyper-proliferation, tumorigenicity, or ectopic tissue formation, but these events have currently not been seen in any of these patients. However, if RPE cells are allogeneic, there are concerns about immune rejection issues that have been raised in previous clinical trials. We therefore performed a preclinical study of allogeneic iPSC-RPE cell transplantation in animal rejection models. We then conducted autogenic or allogeneic iPSC-RPE cell transplantation in clinical studies of patients with age-related macular degeneration. In this review, we focus on immunological studies of RPE cells, including iPSC-derived cells. iPSC-RPE cells have unique inflammatory (immunosuppressive and immunogenic) characteristics like primary cultured RPE cells. The purpose of this review is to summarize the current findings obtained from preclinical (basic research) and clinical studies in iPSC-RPE cell transplantation, especially the immunological aspects.