目的：探讨miRNA-147靶向调控VEGF对人视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响,并初步研究其分子机制。
方法：选择人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19细胞),将细胞分为7组：空白对照组(不处理)、无义miRNA组(转染mimic NC)、miRNA-147模拟物组(转染miRNA-147 模拟物)、抑制剂阴性对照组(转染shRNA NC)、VEGF抑制剂组(转染VEGF抑制剂)、miRNA-147模拟物+空载病毒载体组(转染miRNA-147模拟物和空载体)和miRNA-147模拟物+VEGF过表达组(转染miRNA-147模拟物和VEGF过表达)。使用RT-qPCR检测各组细胞miRNA-147及VEGF mRNA表达水平; 双荧光素酶实验验证miRNA-147与VEGF靶向关系; Western blot检测VEGF蛋白表达水平; MTT法检测细胞增殖; 流式细胞术检测细胞凋亡水平及细胞周期的改变; 细胞划痕实验检测细胞迁移。
结果：与空白对照组和无义miRNA组相比,miRNA-147模拟物组miRNA-147表达水平显著升高,VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与抑制剂阴性对照组相比,VEGF抑制剂组VEGF mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 与miRNA-147模拟物+空载病毒载体组相比,miRNA-147模拟物+VEGF过表达组VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。双荧光素酶报告显示VEGF是miRNA-147的靶基因。转染miRNA-147 模拟物和VEGF抑制剂均可降低ARPE-19细胞增殖和迁移水平,促进细胞凋亡(P<0.05)。转染VEGF过表达可逆转miRNA-147 mimic对ARPE-19细胞增殖、迁移和凋亡的影响(P<0.05)。
结论：miRNA-147可通过靶向VEGF抑制ARPE-19细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。 相似文献
方法：以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建HIF-1α.siRNA 重组质粒。选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只,随机分为正常对照组(15只)和实验组(39只)。实验组采用尾静脉注射链尿佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型,造模成功后将实验组随机分为糖尿病组(15只)、基因治疗组(12只)和空载体组(12只)。正常对照组及糖尿病组大鼠均不做转染; 基因治疗组和空载体组分别转染HIF-1α.siRNA 重组质粒和pSilencer空载体质粒。行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)观察视网膜组织形态,并采用免疫组织化学法检测VEGF蛋白的表达。分别于干扰后24、48、72h,1wk时计算VEGF蛋白的抑制效率。采用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析。
结果：HIF-1α.siRNA 重组质粒经酶切、测序鉴定,确定为目的序列。HE染色显示：正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态基本正常。糖尿病大鼠视网膜各层细胞排列紊乱,内界膜不完整,新生血管芽、新生血管簇呈垂直状突破内界膜生长。免疫组织化学染色显示：VEGF阳性表达为细胞浆出现棕黄色颗粒,主要位于神经节细胞层。正常对照组VEGF蛋白呈弱阳性表达,而DR对照组和空载体组表达明显增强,基因治疗组较DR组和空载体组表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF蛋白抑制率24、48、72h和1wk时分别为：27.4%、40.6%、47.5%、64.5%。
结论：HIF-1α.siRNA重组质粒能够抑制糖尿病大鼠视网膜中VEGF蛋白的表达,可能成为一种治疗糖尿病性新生血管疾病的新方法。 相似文献
方法：体外常氧培养及缺氧培养OCM-1细胞。其中,缺氧培养是通过在培养基中加入浓度为100μmol/L的氯化钴(CoCl2)模拟肿瘤内部缺氧微环境,并将缺氧培养细胞分为单纯缺氧组、HIF-1α干扰组、β-actin阳性对照组、无义寡核苷酸阴性对照组及空载脂质体对照组。体外设计合成siRNA(包括HIF-1α-siRNA、β-actin-siRNA及阴性对照),以LipofectamineTM 2000为载体介导siRNA转染缺氧培养的OCM-1细胞,以RT-PCR和Western blot检测缺氧培养前后及转染前后HIF-1α、Vimentin基因和蛋白的表达。
结果：单纯缺氧组与常氧组相比,HIF-1αmRNA表达无明显差异(P>0.05),蛋白表达显著升高(P<0.01),而Vimentin mRNA和蛋白的表达均显著升高(P<0.01)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.01),证实转染成功; 干扰组HIF-1α、Vimentin mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.01),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。
结论：缺氧可促使OCM-1细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高,并可通过转录激活下游靶基因Vimentin,使其在mRNA和蛋白水平表达均升高,提示HIF-1α可能参与调控葡萄膜黑色瘤的EMT,进而促进肿瘤侵袭、转移; HIF-1α-siRNA转染OCM-1细胞可成功下调HIF-1α及Vimentin的表达,说明从分子水平抑制HIF-1α的表达,可能抑制肿瘤侵袭、转移,从而为肿瘤治疗提供新方向。 相似文献
方法：研究组为人热敏瞬时受体通道1基因通过脂质体介导的方法转染到体外培养的兔角膜内皮细胞中,采用MTT方法观察对细胞增殖的影响,免疫组织化学染色法和计算机图像分析系统检测对细胞增殖细胞核抗原(proliferation cell nucleus antigen,PCNA)表达的影响。
结果：热敏瞬时受体通道1基因转染后内皮细胞增殖增加,实验组与对照组比较差异有统计学意义(t=3.01,P=0.013); 实验组细胞PCNA表达明显增加,与对照组比较差异有统计学意义(t=3.21,P=0.007)。
结论：人热敏瞬时受体通道1基因转染可以促进兔角膜内皮细胞增殖。 相似文献
目的：研究p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)氧化损伤过程中的作用及机制。
方法：将转染p75 NTR受体的RPE细胞作为实验组,未转染的RPE细胞作为对照组。BrdU检测法检测细胞增殖活性; PI/Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率; 激光显微镜观察细胞内ROS的表达情况; 流式细胞仪检测细胞内ROS、线粒体标志物、细胞色素C表达水平; Western blot法检测细胞中Fas蛋白、裂解Caspase-3、VEGF165蛋白的表达水平。
结果：随着p75 NTR受体转染时间的延长,实验组RPE细胞的增殖活性呈逐渐降低趋势,各转染时间点的RPE细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P<0.05); 实验组各转染时间点的RPE细胞增殖活性均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着转染时间的延长,实验组RPE细胞凋亡率呈逐渐增加趋势,各转染时间点的RPE细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.01); 实验组各转染时间点的RPE细胞凋亡率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。实验组ROS荧光信号明显强于对照组。流式细胞仪检测结果显示,实验组RPE细胞中ROS、细胞色素C水平均明显高于对照组,线粒体标志物水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot 法检测结果表明,实验组细胞内Fas蛋白、Caspase-3、VEGF165蛋白的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。
结论：p75 NTR受体高表达可导致RPE细胞线粒体发生损伤,同时促进细胞凋亡,最终导致脉络膜新生血管的形成,表明p75 NTR受体可能是导致RPE细胞发生损伤的因素之一。 相似文献
目的：观察手机光照刺激体外培养人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium; RPE)后形态及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl2-Associated X(Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的mRNA表达变化。
方法：将体外培养的人RPE细胞随机分成4组,根据RPE细胞光照时间长短分为照射3h光照组、6h光照组、12h光照组和0h光照组。在特制的培养箱内,将智能手机屏幕开到最大亮度(200±20Lx)做为光源,持续静音情况下循环播放彩色图片。然后应用苏木精-伊红(HE)染色法,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)染色,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法观察各实验组RPE细胞形态学改变,并运用聚合酶链反应(PCR)技术检测各组细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达变化。
结果：用HE染色、TUNEL染色、MTT法观察发现各光照组RPE细胞形态学无明显改变,差异均无统计学意义(P>0.05)。应用PCR技术检测发现RPE细胞在光照刺激3h光照组和6h光照组,细胞内的Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达与0h光照组的差异均无统计学意义(P>0.05)。但随着光照时间持续延长(12h),细胞内的Bcl-2表达下调,Bax、Caspase-3表达水平均上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论：手机屏幕等作为人造光源在长期持续高亮度照射下会引起体外培养人视网膜色素上皮细胞的损伤。 相似文献
目的：研究TGFBI和微管相关蛋白轻链3(LC3)在角膜营养不良患者中的表达,及氯化锂(LiCl)通过TGFBI对角膜基质成纤维细胞增殖能力的影响。
方法：用免疫组化和Western-blot方法检测角膜营养不良及正常角膜组织中TGFBI和LC3的表达。实验构建了TGFBI过表达载体并转染角膜基质成纤维细胞,分别以5、10、20、40mmol/L LiCl作用于突变型TGFBI转染的角膜基质成纤维细胞,检测不同时间(0、1、6、12h)后,TGFBI与LC3蛋白表达变化,并用CCK-8法检测细胞增殖活性。
结果：TGFBI和LC3在角膜营养不良患者角膜组织中显著高表达。TGFBI过表达抑制角膜基质成纤维细胞增殖活性(P<0.05)。LiCl抑制突变型TGFBI转染的角膜基质成纤维细胞中TGFBI和LC3蛋白表达,并增强其细胞增殖活性(P<0.05)。
结论：LiCl可以促进角膜基质成纤维细胞增殖活性和自噬,其作用机制与下调TGFBI和LC3的表达有关。 相似文献
目的：探讨基因修饰诱导骨髓间充质干细胞分化治疗视神经损伤的效果。
方法：将带有大鼠睫状神经营养因子(CNTF)编码序列的慢病毒转染进入从大鼠股骨中分离出的骨髓间充质干细胞。将采用钳夹视神经方法构建的视神经损伤模型大鼠随机分为对照组和研究组,分别于造模成功后第4、7、10、13d,研究组术眼玻璃体腔内注入经转染的骨髓间充质干细胞悬浮液,对照组术眼玻璃体腔注入等量生理盐水。造模成功后第14d,观察两组大鼠的光反射情况,视网膜神经节细胞数量及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和Caspase-3蛋白表达水平。
结果：研究组大鼠光反射恢复率明显高于对照组(83% vs 25%,P<0.05),视网膜细胞结构相对整齐,可见少量空泡,而对照组大鼠视网膜细胞结构欠整齐,可见明显空泡,视网膜神经节细胞数明显减少,且对照组大鼠视网膜GFAP和Caspase-3蛋白表达水平均高于研究组。
结论：基因修饰诱导骨髓间充质干细胞分化能够有效治疗大鼠视神经损伤。 相似文献
目的：采用不同方法构建乳鼠过敏性结膜炎免疫耐受模型，观察生命早期环境因素对过敏性结膜炎的影响。
方法：Balb/c乳鼠50只随机分为空白对照组、卵清蛋白(OVA)+皮下注射组、OVA+雾化吸入组、OVA+灌胃组、豚草花粉(RW)+皮下注射组、RW+雾化吸入组、RW+灌胃组、屋尘螨(HDM)+皮下注射组、HDM+雾化吸入组、HDM+灌胃组(n=5只/组)。除空白对照组外，各处理组乳鼠分别诱导免疫耐受，成年后再予以相应抗原。通过眼前段照相观察眼表情况，RT-qPCR法检测结膜RANTES、IL-17 mRNA相对表达水平，并通过ELISA法检测血清IL-17浓度。
结果：与空白对照组相比，结膜IL-17 mRNA相对表达水平在RW+灌胃组增高最为显著，RW+皮下注射组增高程度最低(均P<0.05)； 结膜RANTES mRNA相对表达水平在RW+灌胃组增高最为显著(P<0.001)。与空白对照组相比，除OVA+雾化吸入组和RW+皮下注射组外，其他处理组小鼠血清IL-17浓度增高(P<0.05)。
结论：小鼠生命早期皮下注射诱导过敏性结膜炎免疫耐受状态最佳。 相似文献
方法：取第8代牛视网膜血管内皮细胞用于实验。实验组中加入含不同浓度葛根素的培养液,对照组加入不含药物、无生长因子及血清的培养液。培养48h后用Western blotting 法测各组细胞eNOS及ET-1的表达。
结果：与阴性对照组比较,葛根素组eNOS的相对表达量均升高(P<0.01),且随着药物浓度的增加eNOS的表达也增加。葛根素组ET-1的相对表达量均降低(P<0.01),且随着药物浓度的增加ET-1表达下降。
结论：葛根素通过上调 eNOS的表达,下调ET-1的表达,调节血管一氧化氮内皮素(NO/ET)的比值,从而发挥松弛视网膜血管平滑肌的作用。 相似文献
方法：实验分为空白对照组(未经转染BMSC细胞)、阴性对照组(采用不含BDNF基因的空载质粒转染的BMSC细胞)和实验组(采用含BDNF基因的质粒转染的BMSC细胞)。 Realtime PCR 测定基因修饰的 BMSC 细胞 BDNF mRNA表达,ELISA测定基因修饰的BMSC细胞BDNF的分泌表达。
结果：实验组第3、4、5、6、7和8代 BMSC 细胞 BDNF mRNA表达高于空白对照组和阴性对照组,组间差异具有统计学意义( P3：F=491.788,P<0.05;P4：F=380.112,P<0.05;P5：F=1854.929,P<0.05;P6：F=224.540,P<0.05;P7：F=619.155,P<0.05;P8：F=10.092,P<0.05)。实验组BMSC细胞随着细胞传代,BDNF mRNA表达逐渐下降,不同代数间差异具有统计学意义(F=298.603,P<0.05)。实验组3、4、5、6、7和8代BMSC细胞BDNF的分泌表达高于空白对照组和阴性对照组,组间差异具有统计学意义(P3：F=520.609,P<0.05;P4：F=734.520,P<0.05;P5：F=152.847,P<0.05;P6：F=80.372,P<0.05;P7：F=96.083, P<0.05;P8：F=38.532,P<0.05)。实验组BMSC细胞随着细胞传代,BDNF的分泌表达逐渐下降,不同代数间差异具有统计学差异(F=230.084,P<0.05)。
结论：通过基因工程可增强BMSC细胞表达BDNF。 相似文献
方法：选取40只SD大鼠行腹腔注射碘酸钠（ NaIO3,30g／L,100mg／kg）造视网膜变性模型,分为A组不干预组,B组BMSCs注射组,C组BMSCs＋ChABC注射组,D组PBS注射组。造模后28d将ChABC处理或未处理的BMSCs注射入大鼠视网膜下腔,对照组注射PBS液,21 d后处死大鼠并取出眼球,行视网膜HE染色、视网膜细胞凋亡及免疫组化检测。
结果：B组凋亡率、外核层细胞数与A组、D组比较,差异均有统计学意义（P＜0．05）。 C组凋亡率、外核层细胞数与A组、D组比较,差异均有统计学意义（ P＜0．05）。 B组凋亡率、外核层细胞数与C组相比,差异无统计学意义（P＞0．05）。免疫组化显示BMSCs在眼内表达GFAP抗原。结论：BMSCs联合ChABC行视网膜下腔注射可缓解视网膜变性大鼠光感受器细胞的凋亡,延缓细胞数目的减少,从而保护视网膜光感受器细胞。 相似文献
结果：成功构建出具有良好B7-H1表达效力的腺病毒载体,病毒滴度为1.8伊109 PFU/mL,转染腺病毒的小鼠骨髓来源的树突状细胞表现出调节性树突状细胞性能,能够负向抑制免疫应答;在动物模型中使用该型树突状细胞可以有效控制甲状腺眼病的发生发展。
结论：成功构建了表达小鼠B7-H1基因的腺病毒表达载体,转染了该载体的树突状细胞具有调节性树突状细胞的性能,抑制正向免疫应答,能够有效抑制甲状腺眼病的发生发展,揭示基因修饰的树突状细胞可能成为治疗甲状腺眼病的潜在生物制剂。 相似文献
目的：探讨环状RNA(circRNA)circ_0000144是否靶向微小RNA(miRNA)-502-5p调控人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡、迁移侵袭。
方法：将Y79细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-circ_0000144组(转染si-circ_0000144)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-502-5p组(转染miR-502-5p mimic)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-circ_0000144组(转染pcDNA-circ_0000144)、si-circ_0000144+anti-miR-NC组(转染si-circ_0000144+anti-miR-NC)、si-circ_0000144+anti-miR-502-5p组(转染si-circ_0000144+anti-miR-502-5p)。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测视网膜母细胞瘤组织和细胞中circ_0000144和miR-502-5p表达,溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)检测细胞增殖,免疫印迹实验(western blot)测定细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达,流式细胞术分析细胞凋亡,Transwell测定细胞迁移、侵袭。生物信息学预测与双荧光素酶报告实验分析circ_0000144是否靶向miR-502-5p。
结果：31例视网膜母细胞瘤组织中circ_0000144表达量比瘤旁组织高,miR-502-5p表达量比瘤旁组织低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-circ_0000144组Y79细胞中circ_0000144表达量、OD值、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、迁移、侵袭细胞数减少,Bax蛋白表达量、凋亡率增加(P<0.05)。circ_0000144靶向负调控miR-502-5p的表达。miR-502-5p组较miR-NC组增加Y79细胞凋亡率、Bax蛋白表达量,减少OD值、迁移及侵袭细胞数、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量(P<0.05)。与si-circ_0000144+anti-miR-NC组比较,si-circ_0000144+anti-miR-502-5p组Y79细胞凋亡率、Bax蛋白表达量降低,OD值、迁移及侵袭细胞数、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高。
结论：视网膜母细胞瘤组织中circ_0000144高表达,通过负调控miR-502-5p抑制其表达降低视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、迁移侵袭,促进凋亡。 相似文献