作用于烟碱乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素研究进展

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTX)是从热带海洋软体动物芋螺中得到的一类具有生物活性的多肽毒素,能特异性地作用于动物体内各种离子通道及受体,已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注。芋螺毒素包括O-,M-,A-,S-,T-,P-,I-,等多个超家族,其中A超家族的α-芋螺毒素是芋螺毒素家族中的一类重要成员,能特异地作用于乙酰胆碱受体(nAChRs)各种亚型,对疼痛、成瘾、抑郁症、帕金森氏病、肌肉松弛等具有潜在的药用价值。因此,对α-芋螺毒素进行深入系统地研究具有极其重要的意义。本文就作用于nAChRs的α-芋螺毒素的研究现状进行综述。     

α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素,能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关,所以α-芋螺毒素可以开发为研究nAChRs的分子探针或直接作为先导药物进行开发。前期,研究人员从幻芋螺中发现的4种α-3/5型芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,但MIA和MIB对不同亚型的nAChRs阻断活性及选择性还没有深入研究,本研究通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相法合成了α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,并利用电生理技术对它们抑制不同亚型鼠源nAChRs的活性进行系统测定,结果表明MIA和MIB是肌肉型乙酰胆碱受体拮抗剂,半阻断剂量(IC₅₀)分别是14.45和72.78 nmol·L^-1,稍弱于MI与MIC,且对其他神经型nAChRs阻断活性微弱。分子对接研究显示, MIA和MIB与肌肉型nAChRs作用机制类似, N-端氨基酸序列差异是其活性差异的主要原因。本研究表明,芋螺毒素MIA和MIB有潜...     

靶向烟碱型乙酰胆碱受体的芋螺毒素研究进展

芋螺毒素是由海洋肉食性芋螺所分泌的用于捕杀猎物的高活性生物多肽类毒素,据估计,全世界范围内约含100,000种不同的芋螺毒素,按照保守的信号区可分为A、B2、C、D、O、M、T等27个超家族。不同家族的芋螺毒素能够特异性的靶向各种离子通道和受体,因而成为了具有潜在药用价值的先导化合物和研究神经药理学的分子探针。当前报道的靶向烟碱型乙酰胆碱受体的芋螺毒素来自十个超家族,分别为A、B3、C、D、J、L、S、O1、M和T。本文对这十个超家族中靶向烟碱型乙酰胆碱受体的芋螺毒素的序列、结构及功能进行简要综述。     

中国南海桶形芋螺毒液成分及其活性的研究

从海南岛采集了桶形芋螺标本１０ｋｇ。比较了“超低温脆化法”,“匀浆法”,“剥离法”的取毒效果。经凝胶过滤色谱分离后,共得粗毒液 ５０４ｍｇ,其中,Ｐ１,２１０ｍｇ,分子量 Ｍｗ＞５０００;Ｐ２,１８４ｍｇ,Ｍｗ＝１０００～５０００;Ｐ３,５０ｍｇ,Ｍｗ＜１０００。用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）和高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）对 Ｐ２,Ｐ３进行了比较研究。毒液经 ＨＰＬＣ分离后得到数十个成分,各成分多数在２０ｍｇ以内。药理实验表明,它们具有一系列中枢神经活性（ＣＮＳ）。     

αB-芋螺毒素VxXXIVA与α9α10乙酰胆碱受体结合特性的研究

αB-芋螺毒素VxXXIVA（αB-VxXXIVA）是我们从海南产菖蒲芋螺（Conus vexillum）中发现的一个新超家族毒素肽,是α9α10乙酰胆碱受体（nAChR）亚型的特异阻断剂。αB-VxXXIVA仅含有简单的4个半胱氨酸模式（C1-C2C3-C4）,其活性最强异构体的二硫键连接方式是Cys1-Cys2和 Cys3-Cys4。存在于外周神经系统中的α9α10 nAChR是治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌和肺癌的新靶点,具有很重要的临床意义。具有独特结构的αB-VxXXIVA与α9α10 nAChR之间的结合特性尚不清楚。为此,本文对αB-VxXXIVA与α9α10 nAChR受体之间的结合位点和电压依赖性进行了研究。发现它与具有竞争性结合特性的α-芋螺毒素的结合位点有部分重叠,但又完全不相同,是一个新的微位点,其结合活性随膜电压的升高而不会改变,不具有电压依赖性。该研究结果将为αB- VxXXIVA作为工具药开发、α9α10 nAChR受体结构与功能的研究、以及基于该受体为药靶的药物设计提供理论基础。     

芋螺毒素Tx3h的合成鉴定和活性的研究

目的 芋螺毒素是一类结构多样、数量庞大的海洋药源宝库。研究前期从织锦芋螺毒液中发现的芋螺毒素Tx3h,它的的结构和功能未见报道。方法 通过固相多肽合成法（SPPS）人工合成了Tx3h的线性肽,采用一步氧化法对线性肽进行氧化折叠,获得了Tx3h的两个二硫键连接不同的折叠肽异构体（Tx3h-a和Tx3h-b）,并对其氧化折叠条件进行了优化。通过部分还原及烷基化反应,结合MALDI-TOF-MS/MS分析,鉴定了Tx3h-a和Tx3h-b的二硫键连接方式。采用双电极电压膜片钳技术测试了Tx3h-a和Tx3h-b对α4β2和α3β2 nAChRs的抑制作用。结果 通过氧化折叠条件的优化,Tx3h-a和Tx3h-b的产率分别从7.5 %和9.3 %提高到23.7 %和22.4 %。Tx3h-a和Tx3h-b的二硫键连接方式分别鉴定为I-V, II-VI, III-IV和I-VI, II-IV, III-V。在10 μmol/L终浓度下,Tx3h-a和Tx3h-b对α4β2 nAChR的阻断率分别为(35.06 ± 4.90) %和(34.85 ± 3.02) %,对α3β2 nAChR无阻断作用。结论 通过对芋螺毒素Tx3h折叠肽的合成、二硫键连接鉴定以及乙酰胆碱受体活性检测,发现二硫键连接为I-V, II-VI, III-IV和I-VI, II-IV, III-V的Tx3h折叠肽对α4β2 nAChR有更好的选择性,为其后续研究开发奠定了基础。     

α-芋螺毒素特异性结合受体-神经型烟碱乙酰胆碱受体的同源模建及功能预测

目的探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体能被其竞争性拮抗剂α-芋螺毒素选择性阻断的机理。方法采用同源模建的方法构建神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型的三维空间结构,并利用分子对接的方法与已知空间构像的α-芋螺毒素对接。结果已构建的神经型烟碱乙酰胆碱受体α-7亚型结构合理,并与已知空间构像的α-芋螺毒素对接成功。结论传统的烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂缺乏专一性,而靶向神经元神经型烟碱乙酰胆碱受体的α-芋螺毒素种类多,特异性强,与不同亚单位组成的受体亲和力不同,应用潜力很大。     

α-芋螺毒素LvIA特定氨基酸的突变对其活性的影响

α-芋螺毒素(α-Conotoxin, α-CTx)作为烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)的专一性拮抗剂,是研究nAChRs相关药理和生理功能的重要工具。目的 对特异区分α6/α3β2β3和α3β2两种nAChRs亚型的α-CTx LvIA进行研究,确定影响其活性的关键氨基酸位点。 方法 通过序列比对,两步法氧化折叠、双电极电压钳和圆二色谱等技术确定LvIA中影响其活性的关键氨基酸位点,并探索该位点对LvIA影响的机制。结果 确定了LvIA中第五位组氨酸(His,H)的关键作用,当第五位的His分别被丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)和色氨酸(Trp,W)分别取代后,都会导致LvIA对所有受体亚型的活性丧失。圆二色结果表明该位点的变化对LvIA的二级结构没有显著的影响。结论 第5位His是维持LvIA活性的关键氨基酸残基,该氨基酸极性和侧链的变化均会导致LvIA活性的丧失,但是对其二级结构影响较小。LvIA中第5位氨基酸与nAChR的相互作用力是保证其活性的关键。该结论为基于LvIA设计新型专一作用于乙酰胆碱受体的工具探针改造提供了重要信息。     

烟碱α4β2型受体与相关疾病及药物研究进展

4β2型烟碱受体(nAChR)是一种配体门控离子通道,在整个神经系统几乎都有分布,参与乙酰胆碱、多巴胺、γ-氨基丁酸、去甲肾上腺素等神经递质的调节和释放,在机体的学习、记忆、认知、注意力、炎症以及疼痛中发挥重要作用。大量研究表明,α4β2型nAChR是阿尔茨海默症、帕金森病、癫痫、抑郁症、尼古丁依赖、疼痛等神经系统性疾病的重要治疗靶点,对以老年痴呆为主的神经退行性疾病早期诊断和疗效检测具有重要意义。本文总结了α4β2型nAChR在神经系统性疾病治疗中的作用、机制以及相关药物研究进展,为筛选和开发更合适的α4β2型nAChR相关化合物提供理论依据。     

α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达

建立以哺乳动物α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)为分子靶标的药物筛选模型。将大鼠乙酰胆碱受体的α3与β4亚基基因分别进行体外转录,获得α3与β4亚基基因的cRNA,按1∶1的比例将适量α3与β4的cRNA混合后,显微注射到新鲜分离的非洲爪蟾卵母细胞中,在ND96溶液中、17℃下培养24 h后,通过双电极电压钳技术(TEVC)检测受体α3β4 nAChR的乙酰胆碱(Ach)门控电流。同时注入α3、β4 cRNA的非洲爪蟾卵母细胞孵育24h后,可记录到明显的Ach门控内向电流,未注射或只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生。α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,以此为药物作用靶点,可用于大量生物毒素等物质的活性筛选实验模型。     

4种ω-芋螺毒素的合成及活性研究

目的 合成新型ω-芋螺毒素,测定其作用靶标,获得新型镇痛分子并为N-型钙离子通道抑制剂设计提供依据。方法 采用固相法合成线性肽,然后进行折叠、富集和纯化得到纯肽;利用膜片钳技术,测定其对N、P/Q及L-型钙离子通道的抑制活性;利用金鱼测定毒副作用,采用热板法和醋酸扭体法测定活性高毒素的镇痛活性。结果 Ac6.4对N-型钙离子通道抑制活性高,IC50为0.42 μmol/L;C6.4、Castu-c2及Di7.5的抑制活性较低,10 μmol/L的C6.4、Castu-c2及Di7.5的抑制活性分别为（35.58 ± 12.32）%、（31.09 ± 12.24）%及（14.03 ± 4.84）%。该4种ω-芋螺毒素对P/Q、L-型钙离子通道的抑制活性低。1.0~3.0 μg/kg的Ac6.4显著增加小鼠对热板法的痛阈时间,1.0~10.0 μg/kg的Ac6.4显著减少小鼠对醋酸扭体次数,但其镇痛活性均低于齐考诺肽（MVIIA）。Ac6.4的金鱼的毒性显著低于ω-芋螺毒素MVIIA。结论 Ac6.4选择性抑制CaV2.2,且具有较高的镇痛活性及较低毒副作用。     

水分子在尼古丁与α4β2烟碱乙酰胆碱受体结合过程中的作用研究

目的 为了了解水分子在尼古丁与α4β2烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）结合过程中的作用机制以及其在构象稳定中的作用,本研究对尼古丁与α4β2 nAChR的结合进行了分子动力学（MD）模拟。方法 对与激动剂尼古丁结合的α4β2 nAChR体系运行500 ns的全原子分子动力学模拟。结果 模型表明,关键的水分子存在于α4(+)β2(-)的结合部位,形成氢键连接尼古丁的吡啶N、β2 L121的骨架NH原子和N109的羧基氧原子。还发现与尼古丁结合的α4β2 nAChR中,C环开放程度在不同亚基之间有明显的差异,结论 桥接水分子通过形成3个氢键连接尼古丁与受体蛋白,在尼古丁与α4β2受体的结合中起重要作用。     

α-芋螺毒素[A10L]PnIA荧光探针的设计合成及活性研究

α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)广泛分布于中枢和外周神经系统,与多种神经系统疾病、炎症反应密切相关.α-芋螺毒素[A 10L]PnIA作为靶向α7 nAChR的拮抗剂,对研究α7 nAChR相关生理、病理过程具有重要作用.利用荧光素5-羧基四甲基罗丹明标记[A 10L]PnIA,体外两步法氧化折叠获得活性肽([A1...     

4种β2肾上腺素受体激动药对大鼠体外心脏功能影响比较

目的评价β2肾上腺素受体激动药对大鼠体外心脏功能的影响。方法以Langendorff灌流,通过Medlab记录系统观察硫酸沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、硫酸特布他林和富马酸福莫特罗对大鼠体外心脏左心室收缩压、左心室内压上升/下降最大速率、心率和心律的影响。结果选择性β2肾上腺素受体激动药显著增加心脏左心室收缩压、左心室内压上升/下降最大速率和心率,均高于对照值,差异有统计学意义（P＜0.05）,并引起室性期前收缩及心动过速,随浓度增加效应增强;左旋沙丁胺醇和富马酸福莫特罗引起的效应均比硫酸沙丁胺醇小,差异有统计学意义（P＜0.05）;选择性β2肾上腺素受体阻断药可以完全阻断选择性β2肾上腺素受体激动药对心脏的作用,选择性β1肾上腺素受体阻断药部分阻断选择性β2肾上腺素受体激动药对心脏的作用。结论选择性β2肾上腺素受体激动药对心脏有不同程度的毒性作用,左旋沙丁胺醇对心脏的安全性高于硫酸沙丁胺醇,福莫特罗对心脏的影响小于硫酸沙丁胺醇和特布他林,福莫特罗和左旋沙丁胺醇的安全性相当。     

A robust homogeneous binding assay for α4β2 nicotinic acetylcholine receptor

AIM: To develop a homogeneous high-throughput screening (HTS) assay based on scintillation proximity assay (SPA) technology for identification of novel alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) modulators. METHODS: Membrane preparation of HEK293 cells expressing alpha4beta2 nAChR, [(3)H]cytisine and wheat germ agglutinin (WGA)-coupled microbeads were used to develop an HTS assay based on SPA technology. This method was validated against a conventional filter binding approach and applied to large-scale screening of a library containing 32 000 synthetic compounds. Intracellular calcium measurement was carried out to verify the bioactivities of the hits found by the SPA assay. RESULTS: IC(50) values of 2 reference compounds (epibatidine and RJR 2403) determined by SPA and filter binding methods were comparable and consistent with those reported elsewhere. A total of 54 compounds, showing more than 60% competitive inhibition on [(3)H]cytisine binding to alpha4beta2 nAChR, were identified initially following an HTS campaign. Secondary screening confirmed that 17 compounds with novel chemical structures possessed relatively high binding affinity to alpha4beta2 nAChR (K(i)<2 micromol/L). Eight compounds displayed antagonistic effects with >50% inhibition on ABT-594-induced calcium mobilization while none showed any agonist activity. CONCLUSIONS: This homogeneous binding assay is a highly efficient, amenable to automation and robust tool to screen potential alpha4beta2 nAChR modulators in an HTS setting. Its application may be expanded to other membrane receptors and ion channels.     

α-促黑激素类似物与黑素皮质素受体3和4亲和活性的筛选*

目的:筛选具有中枢黑素皮质素受体3和4(melanocortin 3 and 4 receptors,MC3R,MC4R)高亲和活性和选择性的新化合物(α-促黑激素类似物)。方法:从大鼠下丘脑及周围组织中提取富含MC3R和MC4R的膜蛋白,进行放射标记的α-促黑激素([125I]-NDP-α-MSH)配体与MC3R,MC4R的结合实验,求出受体最大结合容量(Bmax)和平衡解离常数(Kd)。用10 nmol.L-1浓度的与MC3R和MC4R高亲和活性的已知激动剂(PT141)和已知阻滞剂(SHU9119)及各受筛化合物进行竞争结合或抑制实验,比较并找出与MC3R和MC4R具有高亲和活性的新化合物。结果:饱和实验求出Bmax=64.81 pmol.g-1蛋白,Kd=0.768 2 nmol.L-1。受筛化合物中LK-FS024与MC3R和MC4R的亲和活性最高,与PT141几乎相同(相对结合率为97%)。结论:LK-FS024与MC3R和MC4R有较高亲和活性,可能是一个具有较好药理研究价值的α-MSH类似药。     

3种生物来源的PLA2对豚鼠回肠M受体的激动作用

目的了解蛇毒MP成分对M受体的激动作用是否为PLA2的共性。方法采用离体生物测定法,分别测定蛇毒MP成分、蜂毒PLA2和猪胰腺PLA2等3种PLA2对豚鼠回肠纵行肌标本张力的影响,绘制量效曲线,计算EC50值。观察阿托品对3种PLA2对豚鼠回肠作用的影响。结果3种PLA2均能剂量依赖性地引起离体豚鼠回肠纵行肌的收缩效应,但最大作用强度仅为CCh的40％～50％。蛇毒PLA2和蜂毒PLA2的EC50值分别为29．5nmol·L-1和24．1nmol·L-1,与CCh的EC50值相当。阿托品能部分拮抗PLA2对豚鼠回肠的收缩作用。结论3种PLA2均具有激动M受体的作用。     

布诺洛尔和普萘洛尔对β肾上腺素受体阻断作用的比较

布诺洛尔(10~(-3),10~(-7),10~(-6)mol/L)能使离体兔右心房肌和豚鼠气管条对Iso所致正性变时性和负性变力性作用的量—效曲线平行右移,pA_2为9.3和9.1。布诺洛尔对心脏β_1受体阻断作用比普荼洛尔强约5倍,对气管β_2受体阻断作用比普荼洛尔强约2.6倍,对心脏β_1受体阻断作用比对气管β_2受体阻断作用略强(约1.6倍)。布诺洛尔(1mg/kg)能完全阻断肾上腺素(10μg/kg)所致大鼠降压反应,对利血平化动物血压及心率无明显影响。     

人淀粉样蛋白前体695基因及人烟碱乙酰胆碱受体α4β2亚单位基因共表达细胞模型的构建

目的为满足寻找可能影响淀粉样β蛋白(Aβ)在阿尔茨海默病过程中的药物实验的需求,建立共表达人淀粉样蛋白前体(APP)695基因和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)α4β2亚单位基因的细胞模型。方法用脂质体转染方法把APP695基因转染进已稳定转染nAChRα4β2亚单位基因的SH-EP1细胞。用500mg.L-1G418加压筛选,并挑选细胞单克隆。用RT-PCR和Western蛋白印迹法对转染后的细胞单克隆进行鉴定,挑取成功转染并高表达APP695的细胞进行克隆。膜片钳检测所挑细胞克隆的α4β2受体功能。结果挑出成功稳定转染人APP695基因及人nAChRα4β2亚单位基因的共表达细胞克隆株。膜片钳方法检测到此细胞克隆株上nAChRα4β2存在活性。结论成功制备了共表达人APP695基因及人nAChRα4β2亚单位基因的细胞模型,为探讨神经元nAChRα4β2亚型对Aβ加工影响的药物实验提供了条件。     

2型糖尿病患者β3肾上腺能受体基因型及其与胰岛素抵抗的相关性研究

目的研究2型糖尿病患者β3肾上腺能受体基因型及其与胰岛素抵抗的相关性。方法选取151例中老年2型糖尿病患者,80例健康体检成年人作为对照。比较糖尿病患者与非糖尿病患者之间的各种生化指标及基因型的差异,胰岛素抵抗患者和非胰岛素抵抗患者各种生化指标及基因型的差异。结果2型糖尿病患者较年龄匹配的非糖尿患者群BMI、SBP、TG、TC、LDL—C、FPG、HbA1c明显升高,而HDL-C显著降低（P〈0．05,P〈0．01）;中老年2型糖尿病组β3 AR 64Arg等位基因频率为：17％,β3ARTrp／Arg等位基因频率为：32．5％,Arg／Arg等位基因频率为：0．6％;对照组β3 AR64Arg等位基因频率为：15％,β3ARTrp／Arg等位基因频率为：30％,无Arg／Arg基因型,两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。胰岛素相对抵抗组BMI、DBP、WHR、三酰甘油、FPG、FINS比明胰岛素相对敏感组显升高（P〈0．05,P〈0．01）;胰岛素相对抵抗组Trp／Arg基因型频率为45．6％,β3AR64Arg等位基因频率为23．5％;胰岛素相对敏感组Trp／Arg基因型频率为26．9％,β3AR64Arg等位基因频率为13．5％;两组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论2型糖尿病患者β3肾上腺能受体基因型与发病无关,但是β3肾上腺能受体基因型与胰岛素抵抗的密切相关。