基于转录组学研究岩藻黄素在扰动剪切应力对EPCs炎性及增殖影响

目的 在扰动剪切应力（Oscillatory shear stress, OSS, ±4 dynes/cm2, 1 Hz）作用下内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）转录组学数据生物信息学分析的基础上,探讨岩藻黄素（Fucoxanthin, FUCO）对OSS作用下的EPCs炎性、增殖以及细胞周期等生物活性改变的影响作用。方法 采用Flexcell flow STR-4000流体系统模拟体内扰动流剪切应力环境;利用Illumina高通量测序平台对相应处理的EPCs进行转录组测序分析,并对筛选到的差异蛋白编码基因进行功能以及通路分析;利用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）验证相应生物信息学数据;Western blot（WB）检测筛选基因-前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）蛋白表达;采用EdU和PI染色分别进行EPCs增殖和周期检测。结果 与静止对照组相比,共计差异表达基因1066个,涉及细胞增殖和死亡、感染性疾病等信号转导通路;GO功能分析显示,该类基因功能主要影响的过程有细胞及细胞组分、细胞进程、细胞器及生物进程等生物活动;根据P值<0.05且Fold change（FC）>2的条件,筛选显著差异基因数17个,并经RT-qPCR以及WB验证,显示PTGS2 mRNA差异表达最为显著（P<0.001）,PTGS2蛋白表达差异明显（P<0.05）;进一步的结果显示,与OSS组EPCs相比,FUCO处理的OSS组EPCs中PTGS2 mRNA表达显著降低（P<0.001）,其蛋白表达被抑制（P<0.05）,并且FUCO处理过的OSS组EPCs增殖活性以及DNA合成能力增强。结论 结合转录组数据基础,提示FUCO能够显著降低OSS引发的EPCs炎症反应,尤其明显抑制炎性因子PTGS2表达;促进EPCs细胞增殖和 DNA合成,这为FUCO临床干预EPCs进而完善心血管疾病干细胞治疗提供理论依据。     

黄精降低活性氧水平促进衰老内皮祖细胞功能的研究

目的观察黄精在老年大鼠内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)传代培养衰老进程中对细胞功能及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响。方法分离培养大鼠骨髓EPCs并鉴定,将培养至第2代的EPCs分为4组,分别用黄精含药血清和空白对照血清继续培养至第4、6、8代。β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老程度;MTT法检测细胞增殖功能;Transwell小室检测迁移功能;体外成血管试剂盒检测成血管功能;流式细胞仪检测ROS水平。结果 EPCs在体外传代培养中,其衰老程度逐渐加重,并伴有增殖、迁移和成血管功能的明显减退,ROS水平急剧升高(P<0.05);经黄精干预后,EPCs衰老程度有所减轻,其功能有所增强,ROS水平明显降低(P<0.05)。结论黄精可能通过降低ROS水平来延缓传代培养EPCs的衰老进程,保护EPCs的功能。     

岩藻黄素对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

摘要：目的 建立胰岛素抵抗细胞模型,探讨岩藻黄素体外改善胰岛素抵抗及降血糖活性。方法 采用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞,筛选最佳诱导条件建立IR-HepG2细胞模型。用不同浓度岩藻黄素处理模型细胞,用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD) 检测岩藻黄素对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响。结果 10-6 mol/L胰岛素处理细胞24 h为建立IR-HepG2细胞模型的最佳条件。5~20 μmol/L的岩藻黄素均可促进IR-HepG2细胞对葡萄糖的利用,10、12.5和15 μmol/L组的糖消耗量显著高于模型组(P<0.01)。结论 岩藻黄素可改善体外IR-HepG2细胞的胰岛素抵抗,促进IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗,具有改善胰岛素抵抗和降血糖活性。     

内皮依赖性超极化因子在剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应中的作用

目的研究内皮依赖性超极化因子(EDHF)在剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应中的作用及机制。方法测定不同流量下的血管内径及各种内皮依赖性舒张因子抑制剂、钾通道抑制剂、细胞色素P450单氧化酶抑制剂作用下的血管内径。结果剪切应力在大鼠肠系膜微动脉引起的舒张反应是内皮依赖性的,且在大的肠系膜动脉明显大于小阻力型肠系膜动脉。EDHF在上述两种动脉的内皮依赖性舒张反应中作用均明显大于NO,起主要作用。剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应不受SKF525A的抑制，ChTx加apamin明显抑制了此舒张反应，TBA则几乎完全抑制此舒张反应。结论在剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应中EDHF起主要作用，钾通道特别是K_Ca通道的激活为主要机制。     

丹酚酸B对EPCs释放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9细胞因子及EPCs黏附能力的影响

目的研究丹酚酸B对血管内皮祖细胞黏附和旁分泌功能的影响。方法从健康人的外周血中分离培养血管内皮祖细胞,鉴定后将其分为对照组(不含丹酚酸B体),20、40、60μg/mL丹酚酸B组,分组后细胞培养48 h,CCK8试剂盒检测血管内皮祖细胞的增殖情况;流动腔实验检测血管内皮祖细胞黏附数量;酶联免疫吸附法检测培养基中细胞因子VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9的浓度。结果体外培养7 d后检测血管内皮祖细胞表面标志物CD34、CD45和VEGRF-2,其中内皮祖细胞比例为89.11%±6.09%;不同浓度丹酚酸B组血管内皮祖细胞培养2 d后,细胞增殖比例与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);流动腔实验结果显示,20、40、60μg/mL丹酚酸B组每个低倍镜视野的细胞计数分别为235±24、393±28和551±35,与对照组(98±13)比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度丹酚酸B培养4 d后,不同浓度丹酚酸B组培养基中VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9浓度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论丹酚酸B可以促进血管内皮祖细胞增殖,增强内皮祖细胞的黏附功能,还可以通过旁分泌途径释放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9。     

黄素单加氧酶3在药物代谢中的作用

黄素单加氧酶(FMO,E.C.1.14.13.8)是重要的Ⅰ相代谢酶,由于与细胞色素P450(CYP450,E.C.1.14.14.1)具有相同的单加氧药物和异物代谢功能,其重要性被明显低估。本文在与CYP450进行对比的基础上,重点对FMO3的功能、变异、调控及应用等方面的最新进展进行了综述,并提出了进行FMO研究的未来策略。     

阿托伐他汀对外周血培养内皮祖细胞数量及功能的影响

目的 观察阿托伐他汀对体外培养外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及功能的影响.方法 分离培养人外周血单个核细胞,分别接种在普通培养基(A组)及阿托伐他汀干预培养基(B组),7d后收集贴壁细胞进行分析.激光共聚焦显微镜下双染色阳性细胞鉴定为正在分化的EPCs,采用transwell小室、细胞计数法评估EPCs扩增、黏附及迁移能力的差别.结果 与A组相比,B组体外培养EPCs的数量显著增多,黏附及迁移能力显著提高.结论 阿托伐他汀在外周血EPCs培养中能促使细胞扩增,增强黏附及迁移功能,可作为EPCs培养的一种改良方法.     

SDF-1对糖尿病外周血EPCs功能的影响及其与PI3K/AKT信号通路的关系

目的观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对糖尿病外周血内皮祖细胞(EPCs)功能的影响,探讨SDF-1对EPCs的影响是否与PI3K/AKT信号通路有关。方法采集糖尿病患者(DM组)和健康对照者(HC组)外周血30 m L,提取并培养EPCs。(1)SDF-1干预组加入100μg/L SDF-1培养液,非干预组加入EGM-2MV培养基,采用Boyden小室和体外血管生成试剂盒观察EPCs的迁移和体外血管生成能力。(2)将培养的EPCs分为空白对照组、1μg/L SDF-1组、10μg/L SDF-1组、100μg/L SDF-1组、单纯AMD3100组及100μg/L SDF-1+AMD3100组,通过Western blot法检测各组EPCs中AKT蛋白的表达水平。结果 (1)无SDF-1干预时,DM组EPCs迁移和血管形成能力低于HC组,SDF-1干预后,2组的EPCs迁移和血管形成能力均较干预前增强,但DM组增强的幅度高于HC组。(2)同一浓度下,DM组的AKT蛋白表达水平均低于HC组(均P<0.01)。无论是DM组还是HC组,AKT蛋白的表达均随着加入SDF-1浓度的增加而呈递增趋势(P<0.05);100μg/L SDF-1+AMD3100组AKT蛋白的表达水平较100μg/L SDF-1组明显降低(P<0.05)。结论 SDF-1可增强外周血EPCs迁移和血管形成能力,对糖尿病患者效果更为明显,且SDF-1对EPCs的影响与PI3K/AKT信号通路有关。     

微环境在肿瘤生长及耐受抗血管生成疗法中的作用

血管生成对多种类型肿瘤的生长具有重要作用,抗血管生成药物的开发为肿瘤治疗开辟了新纪元。然而,与其他的抗肿瘤疗法相同,肿瘤患者对抗肿瘤药物固有／获得性耐受通常导致疾病复发。近年来多种实验模型研究提示,肿瘤及非肿瘤（基质）细胞均参与并导致了治疗反应性的降低。该综述主要总结基质细胞在肿瘤生长及耐受抗血管内皮生长因子疗法中的作用。     

脑细胞衰老在阿尔茨海默症发病机制中的潜在作用

细胞衰老的显著特征是永久的细胞周期停滞,同时伴随细胞代谢、表观遗传调控等变化。阿尔茨海默症(AD)是一种常见的神经退行性疾病,主要症状为记忆力减退和认知功能障碍。大量研究表明,星形胶质细胞和小胶质细胞等中枢神经系统细胞的衰老与AD的发生密切相关,抑制脑细胞衰老有望为AD的防治提供新思路和治疗策略。本文综述了脑细胞衰老在AD发病中的潜在作用及机制、脑细胞之间的相互影响,从而为AD病理机制研究及抗AD药物研发提供新的方向。     

氧化应激致心室重构的研究进展

心室重构意味着血管壁中氧化应激水平的提高,当机体受到有害刺激时,氧化和抗氧化之间失衡,导致大量活性氧簇（ ROS）的产生,加速心室重构的进展。近年来,新型抗氧化剂成为治疗或预防心室重构的靶点,观察抗氧化剂治疗在心室重构患者的长期应用是当下趋势。该文就氧化应激与心室重构之间的关系及相关药物治疗进行综述。     

雌激素对糖尿病大鼠内皮祖细胞功能的影响及其机制研究

目的 探索雌激素对糖尿病大鼠内皮祖细胞(EPCs)功能的影响及其可能的作用机制。方法 取健康Wistar大鼠骨髓提取EPCs并采用流式细胞仪和荧光显微镜鉴定。大鼠给予链脲佐菌素诱导为糖尿病模型,提取正常大鼠和糖尿病大鼠骨髓EPCs并培养,糖尿病大鼠EPCs体外给予雌激素10 nmol/L孵育24 h。检测EPCs增殖和功能;测定EPCs中锰超氧化物歧化酶(MnSOD)水平和NO水平及上清液中凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)蛋白水平。结果 与对照组比较,糖尿病EPCs的细胞增殖能力、迁移能力和小管形成功能受损(P<0.01),而雌激素体外干预后细胞增殖能力、迁移能力和小管形成功能均得到改善(P<0.01);糖尿病EPCs中MnSOD水平和NO水平明显下调,上清液中TSP-1蛋白水平升高(P<0.01);雌激素孵育能逆转上述改变(P<0.01)。结论 雌激素能改善糖尿病大鼠EPCs迁移能力和小管形成功能,作用机制可能与其降低糖尿病EPCs内的氧化应激及下调TSP-1的表达相关。     

The melatonin receptor antagonist luzindole induces the activation of cellular stress responses and decreases viability of rat pancreatic stellate cells

In this study, we have examined the effects of luzindole, a melatonin receptor-antagonist, on cultured pancreatic stellate cells. Intracellular free-Ca²⁺ concentration, production of reactive oxygen species (ROS), activation of mitogen-activated protein kinases (MAPK), endoplasmic reticulum stress and cell viability were analyzed. Stimulation of cells with the luzindole (1, 5, 10 and 50 μm ) evoked a slow and progressive increase in intracellular free Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) towards a plateau. The effect of the compound on Ca²⁺ mobilization depended on the concentration used. Incubation of cells with the sarcoendoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase inhibitor thapsigargin (1 μm ), in the absence of Ca²⁺ in the extracellular medium, induced a transient increase in [Ca²⁺]_i. In the presence of thapsigargin, the addition of luzindole to the cells failed to induce further mobilization of Ca²⁺. Luzindole induced a concentration-dependent increase in ROS generation, both in the cytosol and in the mitochondria. This effect was smaller in the absence of extracellular Ca²⁺. In the presence of luzindole the phosphorylation of p44/42 and p38 MAPKs was increased, whereas no changes in the phosphorylation of JNK could be noted. Moreover, the detection of the endoplasmic reticulum stress-sensor BiP was increased in the presence of luzindole. Finally, viability was decreased in cells treated with luzindole. Because cellular membrane receptors for melatonin have not been detected in pancreatic stellate cells, we conclude that luzindole could exert direct effects that are not mediated through its action on melatonin membrane receptors.     

形成三链DNA的寡核苷酸抑制切应力诱导的大鼠内皮细胞组织因子表达

目的检测针对组织因子(TF)基因启动子区切应力反应元件(shear stress response element，SSRE)设计的反向硫代形成三链DNA的寡核苷酸(antiparallel phosphorothioate triplex-forming oligonucleotide，apsTFO)对大鼠颈总动脉狭窄处内皮细胞TF表达的影响。方法采用硅胶管套扎法建立SD大鼠颈总动脉中段重度狭窄模型。应用原位杂交和免疫组织化学方法结合图像分析系统测定狭窄段内膜TF，Egr-1和Sp1的mRNA表达及蛋白合成。术前0.5 h在尾静脉注射0.5 mg·kg^-1针对TF的SSRE结合位点设计合成的GT20-apsTFO，GT20-psTFO，GT21-apsTFO及部分绿色荧光素(FITC)标记的apsTFO，术后4 h检测血管内皮细胞内的TFO，术后6 h检测TFO对TF的抑制效果及对Egr-1和Sp1的影响。结果给予TFO后，在血管内皮细胞核中可见荧光分布。GT20-apsTFO和GT21-apsTFO对TF的mRNA表达和蛋白合成有显著性抑制(P<0.05)，且GT20-apsTFO的抑制作用较强，与GT21-apsTFO组相比差异有显著性(P<0.05)，GT20-psTFO对TF的mRNA表达和蛋白合成无明显抑制(P>0.05)。GT20-apsTFO，GT20-psTFO和GT21-apsTFO对Egr-1及Sp1的mRNA表达和蛋白合成无抑制作用。结论apsTFO能部分进入血管内皮细胞并在一定程度上抑制TF基因的表达，而不影响Egr-1和Sp1基因的表达。     

咯利普兰对H_2O_2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

目的探讨PDE4抑制剂咯利普兰(rolipram)对H2O2致PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其作用机制。方法以H2O2损伤PC12细胞为氧化应激损伤模型,MTT法检测细胞存活率;碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色流式细胞术检测细胞周期变化;化学比色法测定细胞清除羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2·)的能力;以及培养上清液中的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。Western blot和Real-time RT-PCR检测细胞内硫氧还蛋白(Trx)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。结果咯利普兰能明显提高H2O2损伤的PC12细胞存活率,恢复细胞增殖;提高细胞清除·OH和O2·的能力;降低MDA和NO含量,提高GSH含量和SOD活性;使Trx蛋白和mRNA表达增加,同时下调iNOS蛋白和mRNA表达。结论咯利普兰对H2O2致PC12细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与提高PC12细胞的抗氧化能力相关。     

二甲双胍激活Sirt3信号抑制高糖诱导内皮细胞衰老的实验研究

目的: 研究二甲双胍抑制高糖诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)衰老的作用与机制。方法: 传代培养HUVECs,高糖刺激HUVECs 48 h建立血管内皮细胞衰老模型,采用噻唑蓝法(MTT)检测HUVECs活力,2',7'-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老水平。使用Sirt3抑制剂3-TYP作用HUVECs后,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p53、PAI-1及Sirt3的蛋白表达水平。结果: 与正常对照组相比,高糖组中HUVECs的活力降低,细胞内ROS的水平和MDA含量增加,IL-6、TNF-α的分泌量增加,衰老阳性细胞的百分比增加,二甲双胍干预后能明显改善高糖诱导HUVECs的上述变化。3-TYP能显著逆转二甲双胍对p53、PAI-1、Sirt3蛋白表达的调控作用。结论: 二甲双胍对高糖诱导的HUVECs衰老具有明显改善作用,其作用机制与激活Sirt3密切相关。     

Metformin modulates hyperglycaemia-induced endothelial senescence and apoptosis through SIRT1

Background and Purpose: Endothelial dysfunction can be detected at an early stage in the development of diabetes-related microvascular disease and is associated with accelerated endothelial senescence and ageing. Hyperglycaemia-induced oxidative stress is a major contributing factor to the development of endothelial dysfunction. Clinical data indicate that the hypoglycaemic agent, metformin, has an endothelial protective action; however, its molecular and cellular mechanisms remain elusive. In the present study, we have investigated the protective effect of metformin during hyperglycaemia-induced senescence in mouse microvascular endothelial cells (MMECs).Experimental Approach: MMECs were cultured in normal glucose (11 mM) and high glucose (HG; 40 mM) in the presence and absence of metformin (50 μM) for 72 h. The expression of sirtuin-1 (SIRT1) and senescence/apoptosis-associated markers was determined by immunoblotting and immunocyto techniques. SIRT1 expression was inhibited with appropriate siRNA.Key Results: Exposure of MMECs to HG significantly reduced SIRT1 protein expression, increased forkhead box O1 (FoxO-1) and p53 acetylation, increased p21 and decreased Bcl2 expression. In addition, senescence-associated β-galactosidase activity in MMECs was increased in HG. Treatment with metformin attenuated the HG-induced reduction of SIRT1 expression, modulated the SIRT1 downstream targets FoxO-1 and p53/p21, and protected endothelial cells from HG-induced premature senescence. However, following gene knockdown of SIRT1 the effects of metformin were lost.Conclusions and Implications: HG-induced down-regulation of SIRT1 played a crucial role in diabetes-induced endothelial senescence. Furthermore, the protective effect of metformin against HG-induced endothelial dysfunction was partly due to its effects on SIRT1 expression and/or activity.     

Comparative study of cytotoxicity, oxidative stress and genotoxicity induced by four typical nanomaterials: the role of particle size, shape and composition

Although the biological effects of some nanomaterials have already been assessed, information on toxicity and possible mechanisms of various particle types are insufficient. Moreover, the role of particle properties in the toxic reaction remains to be fully understood. In this paper, we aimed to explore the interrelationship between particle size, shape, chemical composition and toxicological effects of four typical nanomaterials with comparable properties: carbon black (CB), single wall carbon nanotube, silicon dioxide (SiO(2)) and zinc dioxide (ZnO) nanoparticles. We investigated the cytotoxicity, genotoxicity and oxidative effects of particles on primary mouse embryo fibroblast cells. As observed in the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and water-soluble tetrazolium (WST) assays, ZnO induced much greater cytotoxicity than non-metal nanoparticles. This was significantly in accordance with intracellular oxidative stress levels measured by glutathione depletion, malondialdehyde production, superoxide dismutase inhibition as well as reactive oxygen species generation. The results indicated that oxidative stress may be a key route in inducing the cytotoxicity of nanoparticles. Compared with ZnO nanoparticles, carbon nanotubes were moderately cytotoxic but induced more DNA damage determined by the comet assay. CB and SiO(2) seemed to be less effective. The comparative analysis demonstrated that particle composition probably played a primary role in the cytotoxic effects of different nanoparticles. However, the potential genotoxicity might be mostly attributed to particle shape.