桦木酸通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人结肠癌细胞SW620凋亡及自噬

目的 研究桦木酸对人结肠癌细胞SW620凋亡和自噬的影响及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的调控作用。方法 采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性，确定最佳给药时间及给药浓度，用于后续实验；设置空白组、桦木酸低、中、高浓度组。采用苏木素-伊红（HE）染色观察桦木酸对SW620细胞形态的影响。采用Annexin-V/碘化丙啶（PI）双染法检测SW620细胞凋亡率。分别采用Hoechst33258染色及细胞自噬染色（MDC）观察细胞凋亡和自噬体发生情况。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶-9（Caspase-9）、活化的胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3），微管相关蛋白Ⅰ轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、自噬关键分子酵母Atg6同系物-1（Beclin-1）、p62、磷酸化（p）-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。结果 桦木酸以浓度、时间依赖性的方式抑制SW620、HT29、HCT116细胞的活性；与桦木酸给药24 h比较，W620、HT29、HCT116细胞给药48 h细胞活性明显降低（P<0.05，P<0.01），给药48 h的半数抑制浓度（IC₅₀）显著降低（P<0.01），其中SW620细胞给药48 h的IC₅₀最小。HE染色、Hoechst33258染色显示，桦木酸组可见浓度依赖性细胞凋亡；MDC染色可见细胞自噬体数量增加。与空白组比较，桦木酸低、中、高浓度组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）。与空白组比较，桦木酸低、中、高浓度组Bax、Caspase-9、cleaved Caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高（P<0.05，P<0.01），桦木酸中、高浓度组Beclin-1蛋白表达显著升高（P<0.01）；桦木酸低、中、高浓度组p62、p-Akt、p-PI3K、p-mTOR蛋白表达显著降低（P<0.01）。结论 桦木酸对SW620细胞活性有明显的抑制作用，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路从而诱导人结肠癌细胞SW620的凋亡及自噬有关。     

芪玉三龙汤调节mTOR/Beclin1/LC3信号轴相关分子的表达诱导肺癌A549细胞自噬

目的 从细胞水平探讨芪玉三龙汤干预肺癌A549细胞对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）/微管相关蛋白1轻链3（LC3）信号轴关键分子表达的影响。方法 选择肺癌人A549细胞作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）法检测芪玉三龙汤含药血清对A549细胞活性的影响;原位末端标记法（TUNEL）,透射电镜（TEM）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）,蛋白免疫印迹法（WB）分别检测芪玉三龙汤对A549细胞凋亡、自噬体形成及自噬标记分子表达的影响。结果 芪玉三龙汤血清能以浓度依赖性的方式抑制细胞活性;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的凋亡数量显著增多（P<0.01）,自噬体形成增加;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的mTOR mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01）,Beclin1,自噬相关基因5（Atg5）,自噬相关基因13（Atg13） mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）。结论 芪玉三龙汤能够诱导肺癌A549细胞发生自噬,其具体作用机制可能与其下调mTOR的表达,上调Beclin1,Atg5,Atg13,LC3的表达,促进LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ有关。     

JAK1/STAT1/p21通路在姜黄素诱导结肠癌细胞HCT116周期阻滞中的作用

目的 探讨姜黄素对人结肠癌HCT116细胞周期阻滞的影响及其可能的分子作用机制。方法 噻唑蓝（MTT）比色法检测姜黄素（0、12.5、25、50、75、100 μmol·L^-1）和5-氟尿嘧啶（5-FU）（600 μmol·L^-1）处理不同时间（24、48、72 h）对HCT116细胞增殖的影响;流式细胞术检测姜黄素（0、25、50、75 μmol·L^-1）和5-FU对HCT116细胞周期的影响;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HCT116细胞中Janus酪氨酸蛋白激酶1（JAK1）/信号传导及转录激活因子1（STAT1）/细胞周期依赖性激酶抑制因子1A（p21）通路相关蛋白表达的影响;染色质免疫沉淀法（ChIP）检测STAT1与p21启动子区的结合情况;采用小干扰核糖核酸（siRNA）,分别通过Western blot和细胞免疫荧光检测STAT1在调控p21表达中的作用及JAK1蛋白在调控STAT1活化中的作用。结果 与空白组比较,姜黄素各组和5-FU组HCT-116细胞活性明显降低（P<0.05）。与空白组比较,姜黄素组和5-FU组DNA合成前期（G₀/G₁）细胞比例明显升高（P<0.05）,DNA复制期（S）和DNA合成后期（G₂/M）细胞比例及磷酸化p21（p-p21）蛋白水平明显降低（P<0.05）,p21蛋白表达明显升高（P<0.05）。与姜黄素组比较,p21 siRNA+姜黄素组G₀/G₁期细胞明显降低（P<0.05）。与空白组比较,姜黄素处理后细胞中磷酸化STAT1（p-STAT1）水平明显升高（P<0.05）。与姜黄素组比较,姜黄素+STAT1 siRNA组HCT116细胞中p21蛋白表达水平升高（P<0.05）。机制研究表明,与空白组比较,姜黄素处理明显增强了STAT1蛋白在p21启动子区的富集（P<0.05）。与空白组比较,姜黄素处理后细胞中磷酸化JAK1（p-JAK1）水平明显升高（P<0.05）。与姜黄素组比较,姜黄素+STAT1 siRNA组HCT116细胞中的p-STAT1和p21蛋白水平明显升高（P<0.05）。结论 姜黄素诱导的人结肠癌HCT116细胞周期阻滞,其机制可能与激活JAK1/STAT1/p21信号通路有关。     

重楼皂苷Ⅰ诱导G2/M期阻滞及干扰微管结构抗结肠癌HCT116细胞作用机制

目的：探讨重楼皂苷Ⅰ（PPI）对人结肠癌HCT116细胞周期的影响,并研究其作用机制。方法：采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测PPI对HCT116细胞的体外抑制活性;采用Hoechst33258染色法观察PPI对HCT116细胞核数量的影响;采用流式细胞仪检测PPI对HCT116细胞周期的影响;采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶（CDC2）和细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（CDC25C）蛋白的表达和活性,利用细胞免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜检测PPI对HCT116细胞微管的影响。结果：PPI以剂量-时间依赖的方式抑制HCT116的体外增殖,Hoechst 33258染色发现PPI处理组双核细胞数量明显增加（P<0.05,P<0.01）;将其细胞周期阻滞于G₂/M期;PPI未能抑制G₂/M期相关蛋白CDC2,CDC25C的表达和活性,却有促进作用;PPI可导致细胞微管结构紊乱。结论：PPI会导致HCT116细胞阻滞在G₂/M期,其作用机制与干扰细胞内微管结构有关。     

参白解毒方抑制HCT116细胞增殖的药效及机制

目的 探讨参白解毒方（SBJDF）抑制结直肠癌（CRC）细胞HCT116增殖的药效及机制。方法 利用参白解毒方（0、0.25、0.5、1、2、4 g·L^-1）处理HCT116细胞48 h，噻唑蓝（MTT）比色法检测参白解毒方对HCT116细胞活力的影响，分别设置空白组、参白解毒方（1、2、4 g·L^-1）组，倒置显微镜观察参白解毒方对HCT116细胞形态的影响，克隆形成实验观察参白解毒方对HCT116细胞增殖能力的影响，JC-1探针检测参白解毒方对HCT116细胞线粒体膜电位（Δψm）的影响，流式细胞仪检测HCT116细胞周期分布和细胞凋亡率，蛋白免疫印迹法（Western blot）分析参白解毒方对细胞周期，抗凋亡以及核转录因子-κB（NF-κB）信号通路相关蛋白的影响。结果 参白解毒方有效抑制HCT116细胞活力，引起细胞形态改变，呈浓度依赖性；与空白组比较，参白解毒方（1、2、4 g·L^-1）组克隆形成率均明显下降（P<0.05，P<0.01），参白解毒方（2、4 g·L^-1）组诱导HCT116细胞发生G₀/G₁期阻滞（P<0.05，P<0.01）。与空白组比较，参白解毒方（1、2、4 g·L^-1）组周期蛋白D₁（CyclinD₁）表达明显下降（P<0.05，P<0.01），参白解毒方（2、4 g·L^-1）组细胞周期蛋白A₂（CyclinA₂），周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）蛋白表达明显下降（P<0.05，P<0.01），参白解毒方（4 g·L^-1）组周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）表达显著下降（P<0.01）。与空白组比较，参白解毒方（2、4 g·L^-1）组课诱导HCT116细胞凋亡，并下调抗凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关xl蛋白（Bcl-xl）表达（P<0.05，P<0.01），降低HCT116细胞线粒体膜电位；与空白组比较，参白解毒方（2、4 g·L^-1）组可下调NF-κB信号通路相关蛋白IκB激酶α（IKKα）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化p65蛋白（p-p65）的表达（P<0.05，P<0.01）。结论 参白解毒方有效抑制HCT116细胞增殖，其机制可能通过抑制HCT116细胞NF-κB信号通路的激活，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。     

金匮肾气丸通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用

[目的] 探究金匮肾气丸对慢性阻塞性肺疾病（COPD）的作用及其可能的作用机制。[方法] 40只SD大鼠随机分为空白对照组、COPD组、金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组,每组各8只。除空白对照组外,其余组大鼠采用烟熏联合气管内滴注脂多糖（LPS）法建立COPD大鼠模型。各组给予相应药处理AniRes2005动物肺功能分析系统检测大鼠肺功能;酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17（IL-17）水平;苏木精-伊红（HE）染色检测肺组织病理学变化;TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;蛋白质免疫印迹（Western blot）检测自噬及磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径相关蛋白的表达。[结果] 与空白对照组相比,COPD组大鼠肺功能降低,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显升高（P<0.05）,炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;与COPD组相比,金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组大鼠肺功能升高,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显降低（P<0.05）,炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。[结论] 金匮肾气丸可能通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬,延缓大鼠慢性阻塞性肺疾病进展。     

乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬

目的 研究乌药挥发油对人胃癌细胞AGS凋亡和自噬的的影响,并探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的调控作用。方法 利用水蒸气蒸馏法提取乌药挥发油,采用噻唑蓝（MTT）比色法检测乌药挥发油对人胃癌细胞AGS细胞活力的影响,并根据半抑制浓度（IC₅₀）确定最佳给药浓度与时间,用于后续研究;设置空白组、乌药挥发油低、中、高质量浓度组（0、15、30、60 mg·L^-1）及阳性药环磷酰胺（CTX）组（350 mg·L^-1）。用不同浓度的乌药挥发油处理AGS细胞48 h,采用细胞集落形成实验检测细胞增殖能力的变化、流式细胞仪检测细胞周期的变化、细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化、苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态的变化、Annexin-V/碘化丙啶（PI）双染法检测AGS细胞凋亡率、吖啶橙（AO）染色观察自噬水平的变化、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测自噬效应蛋白Beclin-1、p62、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、B细胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切的胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）、剪切的多聚ADP-核糖聚合酶（cleaved PARP）、单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、雷帕霉素机械靶蛋白（mTOR）及磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白表达水平的变化。结果 与空白组比较,AGS细胞经乌药挥发油干预24、48 h,细胞活性被明显抑制（P<0.05,P<0.01）,呈浓度和时间依赖性;乌药挥发油各浓度组细胞增殖与迁移能力明显降低（P<0.05,P<0.01）,且随浓度的上升抑制能力越明显;乌药挥发油将AGS细胞周期阻滞于G₂/M期（P<0.05,P<0.01）,呈浓度依赖性;乌药挥发油各浓度组出现细胞圆化,体积变小并伴随凋亡小体形成等现象,细胞凋亡率明显增加（P<0.05,P<0.01）;随着乌药挥发油浓度的增加,自噬体数量增加致红色荧光逐渐增强,提示自噬水平的提升;乌药挥发油各浓度组Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bax/Bcl-2及AMPK蛋白表达水平明显升高（P<0.05,P<0.01）;p62与p-mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。结论 乌药挥发油通过调节AMPK/mTOR信号通路诱导AGS细胞凋亡和自噬介导的生长抑制。     

18β-甘草次酸通过调控PIM1对宫颈癌细胞及裸鼠移植瘤自噬与凋亡的影响

[目的] 探究18β-甘草次酸（18β-GA）通过调控莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点1（PIM1）对宫颈癌细胞及裸鼠移植瘤自噬与凋亡的影响。[方法] 以浓度梯度（50、100、150 μmol/L）18β-GA作用于宫颈癌Hela细胞,明场与免疫荧光染色观测细胞形态变化,AutoDock Vina软件对18β-GA与PIM1进行分子对接。用100 μmol/L 18β-GA处理敲低及过表达PIM1的Hela细胞,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测增殖抑制率,蛋白印迹检测蛋白表达变化。以Hela细胞构建裸鼠宫颈癌移植瘤模型,成瘤后随机分为18β-GA实验组与对照组,每日分别灌胃100 mg/kg 18β-GA与等量生理盐水溶液。14 d后取移植瘤切片,行苏木精-伊红（HE）染色对比两组移植瘤组织形态,免疫荧光染色与蛋白印迹检测对比移植瘤蛋白表达水平。[结果] 与对照组相比,随着18β-GA作用浓度的增加,PIM1、B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）表达降低,自噬蛋白Beclin-1表达升高,细胞增殖抑制率增高（P<0.05）。敲低PIM1与敲低PIM1后加18β-GA处理组比较细胞增殖抑制率、PIM1、Beclin-1与BCL-2表达水平无明显差异（P>0.05）,而过表达PIM1与过表达PIM1后加18β-GA处理组比较上述结果有显著差异（P<0.05）。18β-GA可以与PIM1稳定结合于PHE-100,结合能为 -7.3 kcal/mol。18β-GA可抑制裸鼠移植瘤组织中PIM1与白细胞介素-6（IL-6）表达,降低信号转导和转录激活因子3（STAT3）磷酸化,进而抑制增殖细胞核抗原（PCNA）、抗凋亡蛋白BCL-2表达,增加Beclin-1表达（P<0.05）。[结论] 18β-GA通过抑制PIM1进而下调BCL-2促进Beclin-1表达,促进宫颈癌细胞自噬与凋亡,减少裸鼠移植瘤STAT3磷酸化,降低PCNA、IL-6表达,进而发挥对Hela宫颈癌小鼠的抑瘤作用。     

白藜芦醇通过PI3K/Akt信号通路协同5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞的抑制作用

[目的] 观察白藜芦醇（RES）对5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗结肠癌敏感性及磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶（Akt）信号通路的影响。[方法] 体外培养SW620细胞,CCK8法检测细胞活力,倒置显微镜分析细胞克隆数,流式细胞术分析细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平。[结果] 与对照组比较,RES组、5-FU组和RES+5-FU组SW620细胞活力、克隆数及p-p85、p-110β、p-PDK1和p-Akt表达水平明显降低,而细胞凋亡率及Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表达水平明显增高（P<0.05）;与RES组和5-FU组比较,RES+5-FU组SW620细胞活力、克隆数及p-p85、p-110β和p-PDK1和p-Akt表达水平明显降低,而细胞凋亡率及Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表达水平明显增高（P<0.05）。PI3K抑制剂LY294002增强RES和5-FU联合处理对SW620细胞生长的抑制作用,而PI3K基因过表达则降低RES和5-FU联合处理对SW620细胞生长的抑制作用。[结论] RES与5-FU协同抑制PI3K/Akt信号通路诱导结肠癌的化疗效果。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬探讨当归四逆汤对痛风性关节炎大鼠的影响

目的 基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路,探讨当归四逆汤对痛风性关节炎（GA）大鼠自噬水平的影响。方法 60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组（0.3 mg·kg^-1）和当归四逆汤低、中、高剂量组（6.54、13.08、26.16 g·kg^-1）,每组10只,并分别给予相应药物灌胃,正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,连续7 d。于第5天给药1 h后向各组（正常组除外）大鼠右侧踝关节注射尿酸钠混悬液（50 g·L^-1）建立GA模型,正常组注射等体积的无菌生理盐水。观察大鼠踝关节肿胀情况;测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β水平;观察踝关节病理形态变化;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测滑膜PI3K、磷酸化（p）-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）、自噬效应蛋白（Beclin-1）、泛素结合蛋白（p62）表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测PI3K、Akt、mTOR、LC3、Beclin-1、p62 mRNA表达水平。结果 与正常组比较,模型组大鼠关节肿胀指数显著升高（P<0.01）,血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P<0.01）,踝关节滑膜组织可见明显炎性细胞浸润和纤维组织增生,滑膜组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p62蛋白表达显著升高（P<0.01）,PI3K、Akt、mTOR、p62 mRNA表达显著升高（P<0.01）,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白和LC3、Beclin-1 mRNA表达降低（P<0.01）。与模型组比较,当归四逆汤中、高剂量组大鼠关节肿胀明显减轻（P<0.05）;血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表达量显著明显降低（P<0.05）;踝关节滑膜组织未见明显炎性细胞浸润,纤维组织增生减轻;滑膜组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、p62蛋白表达量均明显降低（P<0.05）,PI3K、Akt、mTOR、p62 mRNA表达量亦明显降低（P<0.05）,而LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白和LC3、Beclin-1 mRNA表达量均明显上升（P<0.05）。结论 当归四逆汤可以抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,提高大鼠滑膜组织自噬水平,改善痛风性关节炎,并且以高剂量效果最佳。     

消岩汤对A549/DDP细胞自噬及耐药蛋白的影响研究

[目的]通过消岩汤对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP多药耐药及自噬蛋白的影响,探究消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP的耐药逆转作用及探讨相关分子通路。[方法]建立稳定细胞耐药模型,连续灌胃不同浓度消岩汤10 d后,通过血清药理学的实验方法,提取药物血清,用含药血清作用于肺腺癌细胞耐药细胞A549/DDP,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(QPT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Werstern Blot)检测A549/DDP耐药、自噬相关基因的表达及相关通路蛋白的变化。[结果]高剂量消岩汤,低剂量消岩汤和生理盐水作用于肺腺癌耐药细胞A549/DDP,检测A549/DDP细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、肺抗药性相关蛋白(LRP)及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1m RNA和蛋白表达变化,发现高剂量组消岩汤处理细胞株后P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1 m RNA和蛋白均发生降低(P0.05),进一步发现消岩汤可影响AKT1-m TOR相关基因,消岩汤明显降低AKT1,m TOR蛋白的表达。[结论]消岩汤通过影响AKT1-m TOR分子通路进而影响耐药相关蛋白P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1,HMGB1基因的变化。     

基于益肾填精法的茸菖胶囊对无镁诱导癫痫模型自噬相关蛋白影响的研究

[目的]探讨中药茸菖胶囊抗癫痫和神经保护作用的自噬调控机制,为临床应用提供实验依据。[方法]将无镁诱导的新生SD大鼠海马神经元放电模型分为模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、5%茸菖胶囊组、10%茸菖胶囊组、20%茸菖胶囊组,另设正常组,给予相应处理6、12、24、72 h后,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测自噬活性相关蛋白Beclin-1、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的表达。[结果]1)Beclin-1蛋白:4个时间点模型组较正常组无显著变化(P0.05),6 h 20%茸菖胶囊组及72 h 5%茸菖胶囊组较同时点模型组显著升高(P0.05)。2)Bcl-2蛋白:6 h模型组较正常组显著降低(P0.05);12、24 h 20%茸菖胶囊组,72 h 5%、10%及20%茸菖胶囊组较模型组显著增强(P0.05或P0.01),20%茸菖胶囊组较5%及10%茸菖胶囊组增强(P0.05)。[结论]基于益肾填精法的茸菖胶囊对无镁诱导的癫痫模型神经元抗癫痫及神经元保护作用的机制可能与影响Beclin-1蛋白的表达干预自噬过程,促进Bcl-2蛋白的表达抑制细胞自噬有关。     

消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞多药耐药相关蛋白的调控作用

目的探讨消岩汤含药血清对耐顺铂人肺腺癌A545659/DDP细胞多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)及其m RNA表达水平的影响,发现消岩汤对化疗耐药的作用靶点,为肺癌化疗耐药的临床治疗提供理论基础。方法 A549裸鼠皮下移植瘤模型ip给予等量生理盐水,2 mg/kg顺铂,消岩汤低、高剂量(20、40 g/kg)获得含药血清,选择耐顺铂人肺腺癌A549/DDP细胞系作为获得性耐药模型,采用Western blotting免疫印迹法及RT-PCR技术,检测各组含药血清作用下A549/DDP细胞多药耐药基因MRP1、LRP及其产物MRP1、LRP蛋白的表达水平。结果与对照组相比,随着血清中药物浓度的增加,消岩汤低、高剂量组LRP与MRP1蛋白表达逐渐减弱(P0.05)。LRP及MRP1 m RNA水平也有所下降(P0.05),且随着药物浓度的增加,基因表达抑制越明显。结论不同浓度的消岩汤含药血清对MRP1、LRP及其m RNA表达均具有不同程度的抑制作用,且浓度越高,抑制作用越明显,即与剂量呈正相关,揭示消岩汤逆转肺癌耐药可能与抑制MRP1和LRP蛋白功能有关。     

消岩汤逆转肺癌顺铂耐药的机制研究

目的探讨消岩汤逆转肺癌顺铂(DDP)耐药的可能机制。方法 MTT检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞侵袭能力;si RNA转染细胞获取稳定低表达基因的细胞株;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Werstern blotting检测m RNA和蛋白表达水平的变化。结果 MTT检测A549/DDP,在72、96 h,消岩汤能够明显抑制细胞增殖,而在48、72、96 h,DDP联合消岩汤能够明显抑制细胞增殖。划痕实验显示与A549/DDP/si RNA-NC比较,A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞株迁移距离明显缩短。MTT显示与A549/DDP/si RNA-NC比较,A549/DDP/si RNA-Beclin1细胞株增殖能力减低,Westernblotting显示与A549/DDP/siRNA-NC比较,A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞P-糖蛋白(P-gp)和肺耐药相关蛋白(LRP)蛋白表达降低,MTT检测A549/DDP/siRNA-Beclin1细胞,在72、96 h,DDP和消岩汤能明显抑制细胞增殖;而在24、48、72、96 h,DDP联合消岩汤明...     

槲皮素对5-FU诱导的结直肠癌SW480细胞耐药及自噬调控机制研究

目的:探讨槲皮素(Que)调控5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的结直肠癌SW480细胞耐药及自噬的作用及机制。方法:采用浓度递增诱导法建立5-FU耐药细胞株SW480/5-FU,MTT法设置Que高、中、低剂量组(10、20、40 μmol/L)和对照组。MTT法检测各组细胞的5-FU耐药性,TUNEL染色法检测细胞凋亡,免疫荧光检测细胞自噬活性,Western blot检测细胞p糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2抗体(ABCG2)、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、丝/苏氨酸激酶(AKT)、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR蛋白表达。结果:5-FU抑制SW480/5-FU细胞的半抑制浓度(IC₅₀)明显高于SW480细胞(P<0.05),耐药指数(RI)=13.74。与对照组相比,Que中、高剂量组5-FU抑制SW480/5-FU细胞的IC₅₀明显下降(P<0.05),耐药逆转倍数分别为2.27和4.03。与对照组相比,Que中、高剂量组细胞抑制率、凋亡率和自噬活性明显升高(均P<0.05),蛋白的表达均明显升高(均P<0.05),P-gp、MRP1、ABCG2、p62、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达明显下降(均P<0.05)。结论:Que可以以剂量依赖性的方式逆转SW480/5-FU细胞的5-FU耐药性,诱导细胞自噬,其作用机制可能与抑制AKT/mTOR的磷酸化有关。     

清金化痰汤通过调节自噬对COPD大鼠炎症反应的影响

目的:通过观察清金化痰汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠的自噬调节作用,探讨其对COPD大鼠的炎症反应的影响。方法:采用50只SPF级雄性SD大鼠随机分成5组,分别为正常组、模型组、清金化痰汤高、低剂量组(30,10 g·kg~(-1)),罗红霉素组(0. 017 5 g·kg~(-1)),每组10只,除正常组10只外,余40只用单纯烟熏方法建立COPD大鼠动物模型28 d。苏木素-伊红(HE)染色鉴定模型成立后,5组分别灌胃给药14 d,1次/d,模型组、正常组同体积生理盐水灌胃。末次灌胃1 h后处死大鼠提取气道,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)检测其自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3),Beclin~(-1)表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测炎症因子白细胞介素-6(IL-6),IL-8的含量变化。结果:Real-time PCR分析显示,与正常组比较,模型组自噬因子Beclin~(-1),LC3 mRNA表达均有不同程度升高(P 0. 05);与模型组比较,清金化痰汤处理后能够明显改善COPD大鼠气道上皮细胞自噬反应,自噬表达明显减少(P 0. 05),高剂量组与罗红霉素组比较差异不显著。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组自噬蛋白表达明显升高(P 0. 05);与模型组比较,清金化痰汤药物处理组自噬蛋白Beclin~(-1),LC3表达下降(P 0. 05);清金化痰汤高剂量组与罗红霉素组比较差异不显著。ELISA结果显示,模型组大鼠的炎症水平升高,用药处理后大鼠气道上皮细胞内的炎症因子IL-6,IL-8含量均明显下降(P 0. 05)。结论:清金化痰汤能够减轻COPD大鼠支气管的炎症反应,其机制可能与清金化痰汤抑制气道上皮的自噬水平有关。     

健脾消癌方对结肠癌细胞中Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨健脾消癌方含药血清对人结肠癌HCT116细胞蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。方法:以15%健脾消癌方含药血清处理结肠癌HCT116细胞,采用Transwell侵袭实验检测HCT116细胞迁移、侵袭作用,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测HCT116细胞中Akt,磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),mTOR,磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR),核糖体S6蛋白激酶(S6K1),磷酸化核糖体S6蛋白激酶(p-S6K1),真核细胞始动因子4E结合蛋白(4EBP1),磷酸化真核细胞始动因子4E结合蛋白(p-4EBP1)等蛋白的表达,正常血清组设立相同浓度正常血清组(15%),10%胎牛血清组(FBS)。结果:与正常血清组比较,健脾消癌方含药血清组迁移细胞数与侵袭细胞数均显著降低(P 0. 01);与正常血清组比较,Akt蛋白表达无明显下调,p-Akt蛋白表达显著下调(P 0. 01);与正常血清组比较,mTOR蛋白表达无明显下调,p-mTOR蛋白表达显著下调(P 0. 01);与正常血清组比较,S6K1蛋白表达无明显下调,p-S6K1蛋白表达显著下调(P 0. 01);与正常血清组比较,4EBP1蛋白表达无明显下调,p-4EBP1蛋白表达显著下调(P 0. 01)。结论:健脾消癌方抗结肠癌复发转移的机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路的激活有关。     

肠胃清药物血清协同奥沙利铂对人结肠癌耐药细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨肠胃清药物血清协同奥沙利铂(L-OHP)对HCT116/L-OHP细胞增殖及凋亡的影响.方法:采用MTT法检测L-OHP联合肠胃清药物血清对HCT116/L-OHP细胞的生长抑制情况,流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色分析细胞周期分布及Annexin V-FITC试剂盒监测对HCT116/L-OHP凋亡的影响.结果:HCT116/L-OHP细胞对L-OHP的耐药指数为9.17倍,48 h L-OHP作用于HCT116和HCT116/L-OHP的IC50分别为(9.88 ±0.42),(85.81 ±2.76) mg·L-1,联用肠胃清药物血清后HCT116/L-OHP的IC50降至(35.2±2.8) mg·L-1,逆转指数为2.44倍(P＜0.05).联用前后细胞周期分别停滞在G1,G2期及G1期,其中G1,G2期各组间两两比较P＜0.001,S期组间除奥沙利铂组与奥沙利铂联用肠胃清组比较P＜0.05外,余P＜0.001.联用前后细胞凋亡率分别为(8.6±0.31)％,(23.73±2.36)％,各组间除空白组与奥沙利铂组比较P＜0.05外,余P ＜0.001.结论:肠胃清药物血清能有效地逆转人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP对奥沙利铂的耐药,诱导HCT116/L-OHP凋亡,改变细胞周期分布.     

地榆皂苷I基于自噬升高白细胞作用研究

目的研究地榆皂苷Ⅰ(ZgⅠ)升高外周血液中白细胞数量的作用机制。方法昆明种小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、3-甲基腺苷(3-MA)组、ZgⅠ(20 mg/kg)组、ZgⅠ(20 mg/kg)+3-MA组。实验第1天以120 mg/kg剂量ip环磷酰胺诱导小鼠骨髓抑制模型并ig给药,连续给药6 d。实验第6天采用全自动血球计数仪测定小鼠血液中白细胞和中性粒细胞数量;采用透射电镜和免疫荧光显微镜观察造血干细胞自噬程度;流式细胞仪测定造血干细胞凋亡率;Western blotting法检测Atg5、Atg7和Beclin-1蛋白表达水平。结果与模型组和3-MA组比较,ZgⅠ可显著升高骨髓抑制小鼠白细胞数量(P0.05)和中性粒细胞数量(P0.05),激发其造血干细胞自噬的发生,并显著上调造血干细胞中Atg5、Atg7和Beclin-1蛋白的表达水平(P0.01)。结论 ZgⅠ是一种高效的自噬激活剂,其升高白细胞机制可能与促进骨髓抑制小鼠造血干细胞自噬有关。