转化生长因子β1对肾小管上皮细胞中结缔组织生长因子基因启动子活性的影响

目的探讨转化生长因子[β1（TCF-β1）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2中结缔组织生长因子（CTGF）基因启动子活性的调控作用，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径对该生长因子作用的影响。方法构建含有人类CTGF基因启动子的报告基因pCTGF-luc，将其瞬时转染HK-2细胞。通过检测荧光素酶的活性观察TGF-β1和MAPK途径抑制剂对CTGF基因启动子活性的影响。结果TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子的活性。最佳刺激浓度是5ng／ml，最佳刺激时间为12h，荧光素酶相对活性分别为对照组的1．82倍和2．10倍（P〈0．05）。应用PD98059、SB203580和SP600125分别特异性抑制MAPK途径的胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、蛋白激酶p38（p38MAPK）和c-Jun-氨基末端激酶（JNK）通路，对TGF-β1上调CTGF启动子活性的作用有不同影响。PD98059显著增加HK-2中pCTGF-luc的基础活性．并在一定浓度范围内（0．5～10μmol／L）促进TGF-β1的上调作用。SB203580对pCTGF-luc基础活性无影响，但以剂量依赖方式显著抑制TGF-β1的激活效应。而SP600125对基础状态和TGF-β1刺激下CTGF基因启动子活性无影响。结论TGF-β1以剂量和时间依赖方式上调HK-2中CTGF基因启动子活性，在转录水平调节CTGF表达。MAPK途径的ERK和p38MAPK通路可影响TGF-β1的这一调控作用。     

甲状旁腺激素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径在此过程中的作用。 方法 采用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术，观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的情况。使用信号通路抑制剂PD98059、U0126阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 正常HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达水平显著增加。10-10 mol/L PTH作用12 h后，荧光素酶活性较对照组明显升高[（1.8884±0.0780）比（0.9891±0.0300） A，P ＜ 0.01]。正常HK-2细胞有少量p-ERK1/2表达，PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高，以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强；MAPK通路抑制剂PD98059、U0126作用后，CTGF mRNA、蛋白、基因启动子表达均明显下降。 结论 PTH可诱导HK-2细胞CTGF表达，其作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。     

结缔组织生长因子诱导人近端肾小管上皮细胞整合素连接激酶的表达及与激酶信号途径的关系

目的探讨结缔组织生长因子（CTGF）对人近端肾小管上皮细胞系HK-2整合素连接激酶（ILK）表达的影响，以及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（P13-K）途径对该因子表达的影响。方法用不同浓度的CTGF作用HK-2细胞24h及50μg／L的CTGF作用HK-2细胞不同时间，以实时PCR和Western印迹方法检测ILKmRNA及蛋白的表达。用信号通路特异性抑制剂预处理，观察其对CTGF的干预作用。结果CTGF呈时间及浓度依赖性诱导人近端肾小管上皮细胞ILK蛋白表达。5、20、50μg／L的CTGF可使ILK表达量分别增加为对照组的3．284、5．103、5．638倍。50μg／LCTGF使ILK的表达在6h开始升高，高峰在48h（为对照组5．740倍），MEK抑制剂PD98059和P13．K抑制剂LY294002显著降低CTGF诱导的HK-2细胞ILK基因和蛋白的表达（P均〈0．05）。p38MAPK抑制剂SB203580对CTGF诱导的ILK表达无显著影响。结论CTGF能诱导HK-2细胞ILK蛋白的表达，该作用可能与ERK1／2和P13-K信号途径激活有关。     

丝裂酶原活化蛋白激酶激酶1/2抑制对家兔关节软骨保护作用的研究

目的评价丝裂酶原活化蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）信号转导通路中MAPK激酶1／2（MEKI／2）在骨关节炎发病过程中的作用。方法新西兰家兔30只，制作OA模型，随机分成3组，每组10只。从造模术后第4天开始，第1组和第2组分别注射100μmol／L和40μmol／L的PD98059，第3组注射PBS液体作为安慰剂对照组，每周2次。另取10只家兔，正常关节内注射PBS液体作为正常对照组。8周后处死动物，进行股骨髁关节软骨退变的大体评分。用Western Blot印记杂交法测定软骨组织中ERK1／2以及磷酸化ERK1／2的表达。用实时定量PCR方法测定基质金属蛋白酶-1／13（MMp-1／13）的mRNA表达水平。结果与使用PBS的安慰剂对照组相比，使用PD98059的关节软骨破坏明显减轻。磷酸化的ERK1／2在100μmol／LPD98059干预组明显低于40μmol／L干预组和安慰剂对照组。而MMP-1／13的mRNA表达在不同浓度的干预组均低于安慰剂对照组。结论MAPK信号转导通路参与了骨关节炎关节软骨破坏的病理过程。MEK1／2选择性阻滞剂PD98059可以在关节炎动物活体内有效抑制关节炎软骨破坏的程度，该作用可能与其有效抑制ERK1／2的磷酸化激活有关。     

低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的通路研究

目的探讨低密度脂蛋白（LDL）和氧化（OX）LDL是否可诱导人肾小管上皮细胞转分化及其可能机制。方法体外培养的第2代肾小管上皮细胞随机分为（1）阴性对照组；（2）LDL（50mg／ml）组；（3）oxLDL（50mg／ml）组；（4）LDL（50mg／m1）＋PD98059（5μmol／L）组；（5）oxLDL（50mg／ml）＋PD98059（5μmol／L）组。应用形态学、免疫荧光、Western印迹观察LDL和oxLDL刺激小管细胞角蛋白（cytokerafin）、E-钙粘糖蛋白（cadhefin）、α-SMA和波形蛋白（vimenfin）表达的改变、Ⅰ型胶原产生的改变，及其与ERK1／2MAPK通路活化的关系。结果OXLDL较LDL有更强的致小管上皮细胞转分化的作用，与对照组相比。细胞中上皮细胞标记cytokeratin和E-cadherin表达减少，间充质细胞标记α-SMA和vimentin明显增加，Ⅰ型胶原产生增多（P〈0．05）。LDL和oxLDL刺激组细胞中ERK1／2MAPK和GSK-3β磷酸化活化较对照组明显增强（P〈0．05）；β-catenin发生细胞核内转移。MAPK抑制剂PD98059可抑制GSK-3β的磷酸活化，并几乎完全阻断oxLDL诱导的肾小管上皮细胞转分化，但对LDL诱导的小管上皮细胞转分化只有部分阻断作用。结论本研究首次在体外观察到（1）oxLDL可诱导肾小管细胞上皮细胞转分化和Ⅰ型胶原的产生，作用明显强于LDL；（2）ERK1／2MAPK、GSK-3β和β-catenin组成一条信号通路调节LDL和oxLDL诱导的小管上皮细胞转分化。     

金雀异黄素在甲状旁腺激素诱导的人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达中的调控作用

目的 探讨金雀异黄素（Gen）对甲状旁腺激素（PTH）引起的人近曲小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的调控作用。 方法 应用实时定量-聚合酶链反应（real time-PCR）、Western蛋白印迹、报告基因等技术,观察Gen对PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的影响。使用MAPK通路抑制剂U0126阻断信号通路以明确Gen发挥作用的机制。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA和蛋白表达,PTH刺激后其表达量显著增加（P ＜ 0.05）。10-10 mol/L PTH作用12 h后,荧光素酶活性较对照组明显升高（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。Gen剂量依赖性下调PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。正常HK-2细胞有少量磷酸化（p）ERK1/2表达,PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高,以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强。U0126作用后,CTGF mRNA、蛋白表达均明显下降（P ＜ 0.05）。Gen抑制PTH所致的HK-2细胞ERK1/2活化。 结论 Gen可通过阻断MAPK信号通路抑制PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。     

转化生长因子β1在大鼠腹膜间皮细胞中的促炎作用

目的 探讨转化生长因子β1（TGF-β1）在大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）中的促炎作用及机制。 方法 用TGF-β1（10 μg/L）刺激体外培养的RPMC,观察其对RPMC中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的影响。体外转染Smad7和pcDNA3空载体至RPMC后,观察 TGF-β1（10 μg/L）对RPMC MCP-1和p38表达的影响。用p38抑制剂SB203580（10 μmol/L）预处理RPMC后,加入TGF-β1（10 μg/L）,观察阻断p38信号通路对MCP-1表达的影响。 结果RT-PCR结果显示,3 h、6 h、12 h、24 h TGF-β1刺激组腹膜间皮细胞MCP-1表达均显著高于0 h对照组（P < 0.05）,6 h刺激组MCP-1表达达高峰（P < 0.01）。ELISA结果显示,6 h、12 h、24 h、48 h TGF-β1刺激组MCP-1表达增多（P < 0.05）,48 h表达达高峰（P < 0.01）。上调表达Smad7和p38抑制剂SB203580都能明显抑制TGF-β1刺激RPMC产生和分泌MCP-1的作用,与pcDNA3空载体组比较,Smad7治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,SB203580治疗组MCP-1的表达显著下调（P < 0.01）。TGF-β1能活化p38磷酸化的过程,上调Smad7可抑制TGF-β1对它们的激活反应;与正常对照组比较,TGF-β1刺激组磷酸化（p）-p38的表达显著上调（P < 0.05）;与TGF-β1刺激组比较,Smad7治疗组p-p38的表达显著下调（P < 0.05）。 结论 TGF-β1能促进RPMC MCP-1的表达,其促炎作用可能是通过激活p38MAPK信号通路介导的。     

JNK和TGF-β信号途径协同介导CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞中过度表达

目的:比较结缔组织生长因子(CTGF)在瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常真皮成纤维细胞(NF)中的表达以及对血清刺激的反应;研究介导CTGF在KF中表达的信号途径.方法:在血清刺激前30 min给予小分子人工合成的信号通路抑制剂预处理,分别为:P13K抑制剂wortmannin(100nM);ERK抑制剂PD98059(50mM);p38 MAPK抑制剂SB203580(10mM);JNK抑制剂SP600125(25 mM);以及TGF-β I型受体抑制剂SB431542(0.1μM、0.5 μM、1μM和10 μM),空白对照组仅加入溶剂DMSO预处理.使用定量实时反转录聚合酶链反应比较CTGF在瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常皮肤来源的成纤维细胞(NF)中的表达.结果:KF血清刺激后CTGF的表达迅速升高,而在NF血清刺激后仅少量上升.JNK抑制剂SP600125和TGF-β I型受体抑制剂SB431542对CTGF表达的升高具有显著的抑制作用(P＜0.05).结论:KF中的CTGF血清反应需要JNK和TGF-β信号途径的协同作用.     

PD98059对酸性成纤维细胞生长因子诱导的EJ细胞增殖的抑制作用

目的观察细胞外调节蛋白激酶(ERK)激酶MEK1抑制剂PD98059对酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)诱导的人膀胱癌细胞株EJ细胞增殖的抑制作用;探讨aFGF诱导EJ细胞增殖的细胞内信号传导途径。方法用不同浓度的aFGF刺激EJ细胞并测定ERK活性;对aFGF诱导增殖的EJ细胞施以不同浓度的PD98059,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖。结果随aFGF浓度增加,EJ细胞内ERK活性升高,当aFGF浓度为0.6 mg/L,ERK活性是对照组的223.62%; PD98059可使aFGF诱导的EJ细胞增殖比下降,当PD98059浓度为0.1μmol/L,增殖比为46.64%。结论ERK通路是aFGF诱导EJ细胞增殖的重要细胞内信号传导通路,PD98059可抑制aFGF诱导的EJ细胞增殖。     

蛋白激酶C在高糖诱导近端小管上皮细胞细胞外基质及转化生长因子β1高表达中的作用

目的：探讨高糖作用下近端肾小管上皮细胞蛋白激酶C（PKC）活性的变化,以及PKC 激活对近端肾小管上皮细胞外细胞基质（ECM）及转化生长因子β1(TGF-β1）表达的调控作用。方法：采用LLC－PK1细胞株,将细胞分为正常对照组NG(5.5mmol/L D－葡萄糖）、高糖组HG（25mmol/L D-葡萄糖）、高渗组HM（25mmol/L甘露醇）、NG＋PKC抑制剂（PKCI）组（10μmol/L chelerythrine chloride)、HG＋PKCI组、HM＋PKCI组。分别检测各组细胞PKC活性,并运用原位杂交和免疫细胞化学法检测各组Ⅳ胶原（Co1Ⅳ）、纤连蛋白（FN）及TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果：HG组细胞胞膜PKC活性较NG组升高3．3倍。HG组细胞Co1Ⅳ、FN及TGF－β1mRNA和蛋白水平均较NG组显著升高,HM组无此变化。高糖导致的ECM和TGF－β1高表达可被PKC抑制剂chelerythrine chloride所阻断。结论：由高糖诱导的近端小管上皮细胞ECM和TGF－β1高表达是通过激活PKC通路所介导。     

Erk和p38信号转导通路对大鼠肌源性干细胞内结缔组织生长因子表达的调控作用

目的 探讨肌源性干细胞(muscle derived stem cells,MDSC)受转化生长因子β1(transforming growth factor-1,TCF-β1)刺激产生结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的过程中,Erk信号转导通路和p38信号转导通路是否发挥作用.方法 采用细胞差速贴壁法,从新生大鼠骨骼肌中分离提取肌源性干细胞,进行细胞表型鉴定后传代培养.实验设空白组、对照组和实验组共8组:空白组,添加液为基础培养基;对照组,基础培养基中加TGF-β1;PD98059实验组,分别用20、40、80μM的PD98059预处理;SB203580实验组,分别用0.2、0.5、1.0μM的SB203580预处理.用Real Time-PCR和Western Blot分别检测细胞中CTGF mRNA和蛋白质的水平.方果 空白组、对照组和PD98059实验组间CTGF mRNA和蛋白质的相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05),对照组和SB203580实验组间差异均无统计学意义(P>0.05).方论 TGF-β1诱导NDSC产生CTCF的过程中,存在着Erk信号转导途径,不存在p38信号转导途径.     

乳腺癌中雌激素诱导的细胞增殖与有丝分裂素激活蛋白激酶活性的关系

目的探讨雌二醇与有丝分裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号通路的关系以及MAPK在乳腺癌细胞系中的表达情况。方法分别用上皮生长因子(EGF)和不同浓度的雌二醇诱导人类乳腺癌细胞系MCF-7细胞,诱导不同时间后用Western blot方法检测磷酸化ERK1／2的表达;用抗雌激素物质ICI182780和MAPK抑制剂PD98059作用于雌二醇诱导的MCF-7细胞,检测磷酸化ERK1／2的表达;用流式细胞仪检测雌二醇对MCF-7细胞周期的影响。结果MAPK信号通路的诱导剂EGF可以明显诱导磷酸化MAPK的表达;雌二醇也可以诱导磷酸化MAPK的表达。PD98059可以完全抑制雌二醇诱导的磷酸化ERK1／2水平,而ICI182780只能减少雌二醇诱导的磷酸化ERK1／2的表达。随着作用时间的延长,雌二醇可以使MCF-7细胞G2／M期的细胞数增加。结论雌二醇、雌激素受体与MAPK信号途径关系较为密切,MAPK是乳腺癌中重要的调节信号。     

结缔组织生长因子影响体外培养瘢痕成纤维细胞ERK／MAPK信号通路活化及增殖的研究

目的探讨结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）诱导增生性瘢痕（hypertrophic scar,HS）成纤维细胞增殖的信号转导通路。方法采用。H-胸腺嘧啶核苷（^3H—TdR）掺入法观察不同浓度CTGF促HS成纤维细胞增殖的效应,以Western印迹法检测CTGF刺激HS成纤维细胞0、5、10、15、30、60min后,磷酸化及非磷酸化细胞外信号调节激酶1／2（extracellular-signal regulated kinase,ERK1／2）的表达,以两者的比值AI衡量信号通路活化程度;应用特异性阻断剂PD98059阻断ERK通路,MTT法检测CTGF诱导细胞增殖的变化。结果CTGF在一定浓度范围内呈浓度依赖性促HS成纤维细胞增殖,ERK1／2在无CTGF刺激时AI为0．0131±0．0036,CTGF刺激HS成纤维细胞5、10、15、30、60min后,AI值分别为0．0221±0．0033,0．1310±0．0361,0．2090±0．0201,0．1710±0．0379,0．0413±0．0036,在15min达高峰;采用PD98059选择性阻断ERK1／2通路后（A=0．420±0．046）与CTGF刺激组比较（A=0．660±0．035）,细胞增殖显著受到抑制（P〈0．01）。结论ERK1／2是CTGF诱导HS成纤维细胞增殖的主要活化的信号通路。     

热损伤诱导的丝裂原活化蛋白激酶对活化蛋白-1的影响及其意义

目的 观察成纤维细胞热烫伤后丝裂原活化蛋白激酶以及活化蛋白-1的表达。方法 将培养的人成纤维细胞分成4组：(1)单纯热损伤刺激组；(2)热损伤刺激 碱性成纤维细胞生长因子处理组(10μg／L)；(3)预先加入PD98059(10μmoL/L)，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激；(4)预先加入PD98059 SB203580(各10μmol／L)阻断剂30min，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子刺激。伤后0、30、60和180min检测细胞外信号调节激酶(ERK)和原癌基因c-fos蛋白。结果单纯热刺激的成纤维细胞ERK表达增加，随后消失。碱性成纤维细胞生长因子刺激ERK表达增加显著，时间延长。加入PD98059拮抗剂，ERK的表达受抑制。原癌基因c-fos的表达开始增加，随后减弱。同时阻断ERK和p38MAPK两条通路，c-fos弱阳性表达。结论 碱性成纤维细胞生长因子引起热损伤成纤维细胞ERK表达增加，原癌基因c-fos是MAPK信号通路下游重要的靶蛋白。     

血管内皮生长因子抑制肾小管上皮间充质转化及其与结缔组织生长因子和PI3K-Akt信号通路的关系

目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用,及其与结缔组织生长因子（CTGF）、PI3K-Akt信号通路的关系。 方法 （1）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1（5 μg/L,下同）组、VEGF组（100 μg/L,下同）、TGF-β1＋VEGF组。HK2细胞体外培养48 h,用免疫组化双染方法检测肾小管上皮细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E钙黏蛋白的表达。（2）将体外培养的HK2细胞分为正常对照组、TGF-β1组、VEGF组、TGF-β1＋VEGF组、PI3K-Akt信号通路阻断剂LY294002组（25 μmol/L,下同）、TGF-β1＋LY294002组、VEGF＋LY294002组、TGF-β1＋VEGF＋LY294002组。HK2细胞体外培养48 h,用Western印迹和RT-PCR方法检测α-SMA和CTGF的表达;用ELISA方法检测培养上清中纤连蛋白（FN）和I型胶原（ColⅠ）的表达。 结果 免疫组化结果显示,TGF-β1组α-SMA表达比正常对照组增强,而E钙黏蛋白表达减弱; TGF-β1＋VEGF组α-SMA表达比TGF-β1组显著减弱,而E钙黏蛋白表达增强。 TGF-β1组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比正常对照组显著增强（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF组α-SMA、CTGF蛋白和mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1组显著减弱（均P < 0.05）;TGF-β1＋VEGF＋LY294002组α-SMA、CTGF蛋白和 mRNA及FN、ColⅠ表达比TGF-β1＋VEGF组显著增强（均P < 0.05）。 结论　VEGF能抑制TGF-β1诱导的体外培养的HK2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调HK2细胞CTGF表达及减少细胞外FN、ColⅠ合成有关。VEGF的这种作用可能部分通过PI3K-Akt信号转导通路实现,其确切机制有待进一步研究。     

雷帕霉素抑制结缔组织生长因子诱导的成肌纤维细胞增殖及细胞外基质蛋白的分泌

目的 探讨雷帕霉素（RAPA）对于结缔组织生长因子（CTGF）生物学作用的影响及可能机制。 方法 分别用RAPA 20 μg/L 和40 μg/L预处理成肌纤维细胞（MyoF）30 min后再加入CTGF 100 μg/L,与单独加入CTGF（CTGF组）和未加任何刺激的MyoF（对照组）进行比较。采用BrdU掺入法检测细胞的增殖反应;用Western印迹法检测细胞上清中纤连蛋白（FN）的水平及细胞ERK1/2信号的磷酸化。 结果 与对照组相比,CTGF（100 μg/L）显著促进MyoF增殖（P < 0.01）,增加上清中FN的蛋白水平（P < 0.05）。与CTGF组相比,RAPA 20 μg/L及 40 μg/L 预处理可使细胞增殖率显著下降,分别下降了62% 和70%（均P < 0.05）,但两个剂量之间差异无统计学意义;使细胞上清中FN的蛋白水平分别下降了15%和44%,后者与CTGF组的差异有统计学意义（P < 0.05）。CTGF（100 μg/L ）刺激10 min可致MyoF的ERK1/2发生磷酸化,RAPA 40 μg/L预处理细胞30 min可显著降低CTGF诱导的ERK1/2磷酸化。以ERK1/2活化特异抑制剂PD98059（50 μmol/L）预处理30 min后,可以抑制CTGF诱导的细胞增殖效应（7%±5%比85%±7%,P < 0.01）和FN的分泌效应（1.0±0.1比1.6±0.3,P < 0.05）。 结论 RAPA具有部分抑制CTGF的促增殖和促细胞外基质分泌的作用,其作用可能通过抑制ERK1/2信号通路实现。     

G肽对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小管上皮细胞转化生长因子β1活化的影响

目的观察根据血小板反应蛋白1（TSP1）分子WSHW序列人工合成的六肽（GGWSHW，G肽）对由血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化的抑制作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系（HK-2），以未处理HK-2细胞为正常对照，以AⅡ刺激HK-2细胞（AngⅡ组），选择合成TSP1和TGF-β1最佳刺激浓度和时间。刺激前加入10μmol／LG肽进行干预（G肽组），并以AngⅡ受体阻断剂洛沙坦（losartan）为抑制对照（ losartan组）。分别用RT-PCR和Western印迹检测TSP1和TGF-β1以及细胞外基质纤连蛋白（FN）和纤溶酶原活化物抑制剂-1（PAI-1）mRNA转录和蛋白表达。共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TSP1和TGF-β1的表达以及两者共表达。ELISA法检测培养细胞上清液中活性TGF-β1、总TGF-β1、FN和PAI-1的分泌含量。Western印迹检测TGF-β1信号转导蛋白Smad2及磷酸化Smad2（p-Smad2）表达水平。结果AngⅡ以时间和剂量依赖方式促进HK-2细胞合成TSP1和TGF-β1（优化后分别为6h的1μmol／L，12h的0．1μmol／L）。与正常对照组比较，AngⅡ组TSP1与TGF-β1阳性共表达的细胞数上调5．4倍；总TGF-β1和活性TGF-β1水平分别增加1．8和2．0倍；p-Smad2蛋白水平明显上调；FN和PAI-1 mRNA转录水平分别上调3和1．5倍，且细胞上清液中两者含量分别增加2和1．9倍。G肽对TSP1和TGF-β1 mRNA转录和蛋白表达水平均无显著性影响，且对总TGF-β1分泌无明显抑制作用，但可显著抑制活性TGF-β1的水平。此外与losartan组比较，G肽组p-Smad2蛋白表达减少28．9％。FN和PAI-1 mRNA转录水平分别下调34．5％和26％，且细胞上清液中两者含量分别减少11％和8．9％。结论TSP1肽抑制物体外能通过有效竞争抑制TSP1致HK-2细胞的TGF-β1活化作用，并可相应下调FN和PAI-1的合成分泌。     

晚期糖基化终产物诱导人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子

目的观察晚期糖基化终产物（AGE）修饰的牛血清白蛋白（BSA）对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨可能的作用途径。方法将HK-2细胞在体外与不同浓度的AGE-BSA和BSA共同培养。间接免疫荧光法检测糖基化终产物受体（RAGE）。免疫印迹法观察HK-2细胞表达的CTGF蛋白质，ELISA和免疫印迹法检测TGF-β1的合成和分泌。结果在HK-2细胞的胞膜和胞质存在RAGE的表达。AGE-BSA以时间和剂量依赖方式上调HK-2细胞CTGF的表达，8、24、48及72h组分别为0h组的117％、138％、257％及339％：20、50及100mg／L组分别为0mg／L组的186％、240％及287％。在一定的剂量和时间范围内，AGE—BSA能够诱导TGF-β1蛋白质的表达和分泌。抗RAGE和抗TGF-β1的单克隆抗体能够部分抑制AGE-BSA诱导的CTGF蛋白质表达。结论人肾小管上皮细胞表面存在RAGE的表达。AGE—BSA可能部分地通过RAGE介导TGF-β1表达上调。诱导HK-2细胞CTGF表达。     

转化生长因子β1诱导肌纤维母细胞分化机制的研究

目的 探讨肺移植后闭塞性细支气管炎中转化生长因子β1（TGF-β1）诱导肌纤维母细胞分化的机制。方法 闭塞性细支气管炎动物模型采用Smad3野生型和基因敲除小鼠进行的同种异体异位气管移植,并采用原代培养的气管纤维母细胞,通过免疫组化、免疫荧光、Western Blotting、逆转录聚合酶链反应和DNA凝胶电泳迁移率检测等手段,检测肌纤维母细胞分化的标志物α平滑肌肌动蛋白（αSMA）的表达,以及Smad3、p38和ERK1／2的激活。结果 在闭塞性细支气管炎的受累气道中,发现有αSMA的大量表达。对纤维母细胞进行的离体研究,发现TGF-β1诱导Smad3激活,表现为蛋白磷酸化、细胞核转位和DNA结合。TGF-β1引起肌纤维母细胞分化增加,表现为αSMA在转录和蛋白水平的表达增加;而在缺乏Smad3的纤维母细胞中,TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化明显减少（t=2,080,P=0．027;t=1．982,P=0．032）,但未完全消除。TGF-β1可通过激活p38和ERK1／2来促进少量肌纤维母细胞的分化。结论 TGF-β1可通过激活Smad3依赖性和非依赖性信号传导途径,主要是Smad3依赖性途径,来促使纤维母细胞向肌纤维母细胞的转化,最终导致闭塞性细支气管炎的发展。     

PPARγ活化对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞趋化因子表达的干预作用

目的：观察PPARγ活化对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞炎症相关趋化因子表达的影响,探讨其在肾脏纤维化中的干预作用。方法：体外培养肾小管上皮细胞HK-2,LDH法检测15d-PGJ2和TGL对HK-2的细胞毒性,应用不同浓度的15d-PGJ2和TGL作用于TGF-β1诱导下的HK-2细胞,应用实时荧光定量PCR技术和ELISA方法检测趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-8（IL-8）表达的变化。结果：5μmol/L15d-PGJ2和2.5μmol/LTGL不影响HK-2细胞MCP-1和IL-8mRNA基础表达和蛋白分泌。TGF-β1作用24h时,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2及2.5μmol/LTGL均能有效干预TGF-β1诱导的MCP-1mRNA表达和蛋白的分泌（P〈0.05）。IL-8的表达与MCP-1相似,2.5μmol/L和5μmol/L15d-PGJ2能显著抑制TGF-β1诱导的IL-8表达,TGF-β1诱导24h时2.5μmol/LTGL能显著抑制IL-8mRNA表达（P〈0.05）。结论：PPARγ激动剂15d-PGJ2和TGL作用均能有效干预TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞趋化因子MCP-1和IL-8的表达,可能具有有效干预肾间质炎症作用。