EGFRvⅢ上调FAK磷酸化促进人胶质瘤细胞迁移

目的：探讨表皮生长因子受体突变体Ⅲ（epidermal growth factor receptor mutation typeⅢ，EGFRvⅢ）促进入胶质瘤细胞迁移运动的可能机制。方法：利用反转录病毒感染技术建立EGFRvⅢ过表达的人胶质瘤细胞U87 EGFRvⅢ，琼脂滴细胞迁移实验和Transwell细胞迁移实验观察EGFRvⅢ对细胞迁移运动的影响；Western印迹法检测黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化的变化。将FAK突变体FAK（Y397F）导入U87 EGFRvⅢ细胞，观察细胞侵袭运动变化。结果：EGFRvⅢ促进入胶质瘤细胞U87的迁移运动，同时使FAK397位点磷酸化水平上调。将FAK突变体Y397F转入U87 EGFRvⅢ细胞，FAK磷酸化水平下调同时细胞迁移能力下降。结论：EGFRvⅢ通过上调FAK397位点磷酸化水平来促进胶质瘤细胞的迁移。     

STIP1在脑胶质瘤组织中的表达及对胶质瘤细胞株增殖、凋亡、侵袭的影响

目的:检测磷酸化应激诱导蛋白1（stress-induced phosphoprotein 1,STIP1）在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异,探讨STIP1对胶质瘤细胞株U87、U251细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、免疫组化及蛋白印迹检测胶质瘤组织和正常脑组织中STIP1的表达;小干扰RNA（STIP1-siRNA）转染U87、U251细胞株后,使用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室观察细胞的增殖、凋亡和侵袭能力。结果:STIP1在胶质瘤Ⅳ级组织中的表达明显高于正常脑组织,但在胶质瘤Ⅱ、Ⅲ级中的表达与正常脑组织无明显差异。U87、U251细胞株转染STIP1-siRNA后,细胞增殖和侵袭能力明显受到抑制,而细胞凋亡率明显上升。结论:STIP1在胶质母细胞瘤组织中高表达,下调STIP1可以抑制胶质瘤细胞株U87和U251的增殖,阻滞细胞周期,促进其细胞凋亡,并可抑制其侵袭力。     

腺病毒介导PTEN基因对胶质瘤增殖与侵袭力的影响

脑胶质瘤为神经外科的常见病、多发病 ,约占颅内肿瘤的 45 % ,其主要治疗手段包括手术切除、化学治疗与放射治疗 ,其生存时间短、预后差 ,平均生存时间不足 1年 ,这与其具有高增殖性及高侵袭性有关。本实验应用腺病毒作为载体介导抑癌基因PTEN体外转染人脑胶质瘤细胞U87,检测其细胞增殖力与体外侵袭力的改变 ,进而探讨PTEN作为胶质瘤基因治疗靶点的可能性。分别用的Ad PTEN(实验病毒 )、Ad LacZ(对照病毒 )感染人胶质瘤细胞U87(病毒滴度为 5× 1 0 8pfu/ml,MOI为 5 0 ) ,同时用无病毒感染的U87作空白对照 ,首先用RT PCR检测PTE…     

MiR-29a下调共刺激分子B7-H3的表达及其对脑胶质瘤细胞侵袭的影响

目的： 探讨miR-29a调控共刺激分子B7-H3在脑胶质瘤中的表达及其对脑胶质瘤细胞侵袭能力的影响。 方法： 通过Real-time PCR检测miR-29a和B7-H3在正常脑组织、脑胶质瘤组织及人胶质瘤细胞株U87中的表达,并利用脂质体将miR-29a的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors）转入U87细胞,流式术验证miR-29a对B7-H3表达的调节效果;采用CCK-8和Transwell实验观察miR-29a对U87细胞的增殖和侵袭能力的影响,并通过流式术分析miR-29a干预前后U87细胞上与细胞侵袭相关的化学趋化因子的表达变化,以miRtarbase等软件预测miR-29a与 CXCR4 的结合能力。 结果： 胶质瘤组织及细胞株中miR-29a低表达而 B7-H3 mRNA高表达,且均与瘤组织病理分级相关。转染miR-29a mimics可以有效下调U87细胞中 B7-H3 mRNA的表达。转染miR-29a mimics可以显著抑制U87细胞的侵袭能力（P<0.05）,但对细胞增殖并无显著影响。miR-29a过表达可同时下调U87细胞中CXCR4的表达,但软件分析 CXCR4 基因上并不存在miR-29a的结合位点。 结论： miR-29a可有效下调B7-H3分子的表达,进而抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力,其作用机制可能与CXCR4途径相关。     

EGFRvⅢ的siRNA对胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响

目的研究EGFRvⅢ的siRNA对U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞中EGFRvⅢ的表达及其对细胞增殖和凋亡的影响。 方法化学方法合成特异针对EGFRvⅢ的siRNA,转染U87-EGFRvⅢ细胞后,利用半定量RT-PCR法检测细胞中EGFRvⅢ的mRNA表达,采用蛋白印迹法和免疫荧光法检测细胞中EGFRvⅢ的蛋白表达水平,MTT法检测siRNA对胶质瘤细胞增殖的作用,Annexin V-FITC/PI法检测siRNA对细胞凋亡的作用。结果RT-PCR、蛋白印迹法和免疫荧光法均可显示EGFRvⅢ siRNA可使EGFRvⅢ的基因和蛋白表达显著下降,48 h内可使蛋白含量下降(757±31)%;MTT法和Annexin V-FITC/PI检测结果显示siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖并促进其凋亡。 结论EGFRvⅢ siRNA可特异地抑制EGFRvⅢ在胶质瘤细胞中的表达,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。     

野生型PTEN基因对胶质细胞瘤侵袭力的影响

目的观察转入野生型PTEN基因的胶质瘤细胞体外侵袭力改变,探索PTEN基因对胶质瘤细胞影响方式.方法构建野生型PTEN基因的pcDNA3.1 Hygro(-)真核质粒载体,并用于转染PTEN基因失活的U251细胞系,采用重组基底膜侵袭模型,观察转染前后细胞侵袭力的改变.结果转染PTEN基因可以明显抑制U251细胞的侵袭力.结论 PTEN基因可通过抑制胶质瘤细胞的侵袭力达到抑制肿瘤生长.     

PTEN在人脑胶质瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

背景与目的:PTEN基因的缺失及突变与多种肿瘤有关,而脑胶质瘤是与PTEN基因变异关系最为密切的恶性肿瘤之一.本研究旨在观察PTEN基因对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响,为PTEN用于胶质瘤基因治疗提供科学的实验依据.方法:(1)应用RT-PCR方法扩增人脑胶质瘤细胞U251、SHG-44中PTEN基因,序列测定分析.(2)采用阳离子聚合物转染试剂,将携带野生型PTEN基因的重组真核表达载体质粒转染至胶质瘤细胞,G418筛选出稳定转染的细胞并扩增培养.通过细胞形态学、细胞生长曲线观察PTEN基因表达对细胞形态和增殖的影响,应用Western blot、免疫细胞化学法检测相关蛋白的表达.结果:(1)胶质瘤细胞U251和SHG-44的PTEN mRNA分别存在着突变型、缺失型两种表达方式.(2)稳定转染的U251和SHG-44细胞株的生长曲线显示细胞增殖明显受抑制,第7天细胞计数分别为未转染对照组细胞数的39.1%、27.8%;Westem blot显示稳定转染细胞株有外源性PTEN蛋白的表达;细胞免疫化学法显示胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达量增加,从而表现出对细胞形态影响的差异,稳定转染的U251细胞出现向星形细胞分化的特征,SHG-44细胞形态转染前后无明显改变.结论:恢复野生型PTEN基因表达对胶质瘤细胞存在差异性的诱导分化作用.     

KIF20A对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡及细胞周期分布的影响

目的:研究KIF20A对胶质瘤U87细胞系增殖、侵袭、迁移、凋亡及细胞周期分布的影响。方法:利用 RNA干扰技术下调胶质瘤细胞系 U87中 KIF20A 的表达。RT-qPCR 和 Western blot 分别检测 KIF20A 在mRNA 和蛋白水平上的表达。CCK-8 实验检测 U87细胞增殖能力的变化,Transwell 实验检测U87细胞迁移及侵袭能力的变化,流式细胞术检测 U87细胞凋亡及细胞周期的变化。结果:RT-qPCR和Western blot 结果显示 siRNA-KIF20A显著下调 KIF20A 的表达,CCK-8和Transwell 实验显示下调 KIF20A 的表达显著抑制了U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力,流式细胞术结果显示下调 KIF20A 的表达显著促进了U87细胞的凋亡,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:下调KIF20A的表达抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移及侵袭,促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡并诱导细胞周期G0/G1期阻滞。     

Ad.RGD-ING4-PTEN对神经胶质瘤U87细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨经RGD修饰的生长抑制因子4(inhibitor of growth 4,ING4)基因与第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)双基因共表达的腺病毒载体(Ad.RGD-ING4-PTEN)体外对神经胶质瘤U87细胞的增殖、凋亡及侵袭的影响.方法:以Ad.RGD-ING4-PTEN为实验组,Ad.RGD-ING4/-PTEN为单基因对照组,PBS、Ad.RGD/Ad-GFP为空白对照组,分别体外感染U87神经胶质瘤细胞.Western blotting检测目的基因ING4和PTEN在U87细胞中的表达,MTT法检测实验组病毒感染对U87细胞增殖的影响,流式细胞术及Real-time PCR法检测神经胶质瘤细胞凋亡及凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、caspase-3、HIF-1α)表达变化,划痕实验及Transwell实验检测实验组病毒感染对U87细胞迁移及侵袭能力的影响,Real-time PCR法检测侵袭相关基因(MMP-2、MMP-9)表达变化.结果:成功检测到ING4和PTEN仅在实验组及相应单基因对照组中表达.实验组第5天细胞抑制率可达(83.1±4.6)％、凋亡率可达(40.7±4.3)％,与单基因组及空白对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);实验组能明显上调U87细胞中Bax、caspase-3和下调HIF-1α、Bcl-2等细胞凋亡相关蛋白的表达(均P＜0.05),而且肿瘤侵袭相关分子MMP-2、MMP-9的表达也明显下调(均P＜0.05);实验组细胞迁移距离[(70.1±6.2)μm]和穿膜细胞数[(26.6±3.5)个]均明显减少,与单基因组及空白对照组比较差异有统计学意义(均P＜0.05).结论:与单基因腺病毒相比,Ad.RGD-ING4-PTEN双基因具有更显著的抑制U87神经胶质瘤细胞增殖、诱导其凋亡,并抑制其迁移及侵袭能力.     

银杏叶提取物通过调控NF-κB信号通路抑制神经胶质瘤U87细胞增殖和侵袭

[目的]评价银杏叶提取物(EGb761)对神经胶质瘤U87细胞的生长与侵袭的影响,并进一步分析EGb761对U87细胞作用的分子机制。[方法]体外培养人神经胶质瘤U87细胞,给予不同浓度(0、100、200、400mg/L)银杏叶提取物干预(24h、48h、72h)后,采用CCK-8技术检测EGb761对U87细胞增殖的影响。Transwell小室和流式细胞凋亡技术分析EGb761对U87细胞侵袭和凋亡的影响;Western blot检测EGb761处理后U87细胞内NF-κB与cyclin D1、 iNOS和COX-2蛋白的表达变化。[结果]银杏叶提取物可有效抑制神经胶质瘤U87细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡;Western blot提示EGb761干预的U87细胞内NF-κB与cyclin D1、 iNOS、COX-2蛋白的表达均明显下调。[结论] EGb761抑制神经胶质瘤U87细胞的生长增殖和侵袭能力,其可能是通过NF-κB信号通路而发挥抗肿瘤作用的。