桑白皮及其混伪品的DNA条形码鉴定研究＊

为了探索鉴定桑白皮及其混伪品的新方法,本实验提取桑白皮药材及其混伪品的DNA,对 ITS2序列进行 PCR 扩增和双向测序,应用 CodonCode Aligner V3.0对测序峰图进行校对拼接,去除低质量序列及引物区,获得 ITS2序列。利用MEGA4.0软件计算物种种内种间Kimura 2-pa原rameter（K2P）遗传距离。采用相似性搜索法、最近距离法、构建 NJ系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果表明桑白皮药材与其混伪品之间的K2P遗传距离分布于0.003~0.343,大于桑种内K2P遗传距离0,NJ树也显示桑白皮可与其混伪品明显分开。因此,ITS2条形码可有效鉴别中药材桑白皮及其混伪品,为快速准确地鉴定桑白皮提供了科学依据和新的方法。     

中药材半夏及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

目的：采用ITS2序列对中药材半夏及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,为规范中药材半夏的市场流通,保障临床用药安全及疗效提供参考依据。方法：对半夏及其混伪品共59份样品,通过DNA提取及聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2序列,并采用Mega6.0软件进行多序列比对,计算种内及种间K2P遗传距离,采用邻接（NJ）法构建NJ系统聚类树。采用相似性搜索法、最小距离法、NJ 树法考察ITS2序列的鉴定能力。结果：半夏药材的ITS2序列长度为251 bp,应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定半夏药材及其混伪品;半夏种内最大K2P距离小于半夏与混伪品间的最小K2P距离;NJ树显示半夏药材可与其混伪品明显分开。结论：ITS2序列能准确、稳定鉴定中药材半夏药材及其混伪品。     

蔓荆子药材及其混伪品DNA条形码鉴定研究

本研究应用ITS2序列鉴别蔓荆子及其混伪品,收集药材和基原植物样本共46份,通过提取基因组DNA、PCR扩增和双向测序获得ITS2序列,经CodonCode Aligner V4.2拼接注释获得序列,应用MEGA5.0对序列进行分析比对,计算种内和种间遗传距离（Kimura 2-Parameter,K2P）,构建系统发育NJ树进行鉴定。结果表明,蔓荆子药材基于ITS2序列的种内最大K2P遗传距离均小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离,NJ树显示蔓荆子药材与其混伪品可明显分开,表现出良好的单系性。因此,应用ITS2序列能够准确地鉴定蔓荆子药材及其混伪品。     

应用ITS2条形码鉴定中药材合欢皮、合欢花及其混伪品

为准确鉴别中药材合欢皮、合欢花及其混伪品,该研究应用ITS2条形码对46份药材及其混伪品进行鉴定研究。通过对样本进行基因组DNA提取,PCR扩增和双向测序获得ITS2序列。所得序列经CodonCode Aligner 拼接后,基于隐马尔可夫模型的HMMer 注释方法去除两端5.8S 和28S 区段,用软件MEGA5.0对序列进行分析比对,并基于K2P模型进行遗传距离分析。采用相似性搜索法、最近距离法、构建NJ树对序列鉴定能力进行评估。结果表明,药材基原物种合欢的ITS2序列种内最大K2P遗传距离均远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;应用相似性搜索法分析结果表明ITS2 序列可准确鉴定合欢药材及其混伪品;NJ树显示合欢药材与其混伪品可明显区分开,表现出良好的单系性。因此,应用ITS2条形码可稳定、准确地鉴别合欢药材及其混伪品。     

基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品

为应用ITS2序列对前胡、紫花前胡药材及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,该文依据国家药典委员会公布的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》,PCR扩增前胡、紫花前胡及其混伪品的ITS2序列并进行双向测序。经CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接,采用MEGA5.0软件分析相关数据。结果表明:前胡药材的ITS2序列长度为229~230 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.005。紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp,种内无变异。前胡、紫花前胡药材与其混伪品的种间平均K2P遗传距离分别为0.044,0.065。紫花前胡的种间最小K2P遗传距离明显大于其种内的最大K2P遗传距离。最小距离法和NJ树鉴定结果表明前胡、紫花前胡均能与其混伪品明显区分。因此,ITS2序列可有效鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。     

基于ITS2序列鉴定苗药金铁锁及其混伪品

目的：本研究利用ITS2序列对苗药金铁锁及其混伪品进行鉴定研究,从而确保药材质量,保障临床用药安全。方法：提取金铁锁药材及其混伪品基因组DNA,PCR扩增并双向测序获得ITS2序列。所有序列经过CodonCode Aligner V3.7.1拼接后,采用MEGA5.1软件进行序列比对,计算种内和种间Kimura2-Parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。采用相似性搜索法、最近距离法、邻接（NJ）树法对ITS2序列鉴定能力进行评估。结果：金铁锁药材的ITS2序列长度为229 bp,其ITS2序列种内最大K2P遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P遗传距离;应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定金铁锁药材及其混伪品;基于ITS2序列构建NJ树,金铁锁及其混伪品均表现出良好单系性,均能明显区分。结论：ITS2序列能够稳定、准确地鉴定金铁锁药材及其混伪品,DNA 条形码技术可为金铁锁药材及其混伪品的鉴定提供新的方法。     

山茱萸药材及其混伪品的ITS／ITS2序列鉴定研究

利用DNA条形码技术准确快速鉴定山茱萸药材及其混伪品。方法：提取山莱萸及其混伪品的基因组DNA,利用PCR技术扩增它们的ITS序列。所得序列经双向测序后用CodonCode AlignerV3．5．4软件进行拼接和质量评估,用MEGAV5．0计算种内、种间的遗传距离,构建NJ（邻接）树鉴定山茱萸药材及其混伪品。结果：山茱萸药材的ITS序列长度均为659bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为O．005,远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0．357。不同来源的山茱萸药材ITS2序列无变异,长度均为250bp,其与混伪品的种间平均K2P遗传距离为0．571。ITS／ITS2序列的NJ系统聚类树和BLAST比对结果均可明显区分山茱萸药材及其混伪品,表现出良好的单系性。结论：ITS／ITS2序列可准确有效鉴定山茱萸药材,为临床安全用药奠定了基础,也为其它药材的分子鉴定提供了新的思路。     

苍耳子药材及其混伪品ITS2 序列鉴定研究

目的：应用ITS2 序列快速并准确地鉴定中药材苍耳子,为其药材质量、用药安全提供保障。方法：提取苍耳子药材及其混伪品的基因组DNA、扩增ITS2 序列并测序,采用软件CodonCode Aligner V 4. 2 对测序峰图进行校对拼接,并对峰图进行质量控制。应用MEGA 5.0 软件计算种内种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,构建邻接（NJ）系统聚类树。结果：苍耳子药材基原物种种内K2P 遗传距离为0,药材基原物种与其他混伪品的K2P 遗传距离分布于0.009~0.542;NJ 树结果显示苍耳子药材与其混伪品均可明显区分。结论：ITS2 序列适用于中药材苍耳子及其混伪品鉴别,进一步验证了DNA 条形码技术鉴定中药材的有效性。     

白芷药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定

目的:应用ITS2序列对白芷、杭白芷及其混伪品进行鉴定研究,为白芷药材的准确鉴定提供依据。方法:提取样品总DNA,扩增ITS2序列并双向测序,计算种间、种内Kimura-2-parameter(K2P)遗传距离,并构建系统邻接(NJ)树。结果:白芷的ITS2序列长度为227 bp,平均GC含量为55. 05%,种内最大K2P遗传距离为0. 009 2;杭白芷ITS2序列长度均为227 bp,GC含量为55. 07%,种内无变异位点。白芷与杭白芷种内最大遗传距离均远小于其与混伪品的种间K2P遗传距离。NJ树结果显示白芷与杭白芷聚为一支,可与其他混伪品明显区分开。结论:ITS2序列能有效地鉴定白芷药材及其混伪品,为白芷药材市场流通管理及临床用药安全提供了新的技术手段,也为其他中药材及其混伪品的鉴定提供参考。     

鸦胆子药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定研究

目的:通过分析鸦胆子及其混伪品的ITS2序列,探究鉴定鸦胆子药材及其混伪品的新方法。方法:采用改良的CTAB法提取鸦胆子及其混伪品的基因组DNA,PCR扩增ITS2片段。对其进行双向测序,应用MEGA6.0软件进行序列分析,计算种内、种间遗传距离,构建邻接树。结果:鸦胆子药材ITS2序列长度为230 bp,种内最大K2P遗传距离为0.018,小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0.493。NJ树结果表明鸦胆子序列和柔毛鸦胆子序列聚为一支,与其他混伪品可明显区分。鸦胆子与柔毛鸦胆子在35位点处有一变异位点,利用此位点能将鸦胆子与柔毛鸦胆子区别开来。结论:ITS2可作为鸦胆子药材及其混伪品鉴定的DNA条形码序列,为保障临床用药安全提供了新的技术手段。     

基于ITS2 序列鉴定南北葶苈子药材及其混伪品

目的：利用ITS2 序列对多基原药材葶苈子及其混伪品进行分子鉴定,以保证药材质量及临床疗效。方法：提取46 份葶苈子药材及其混伪品的DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2 序列并双向测序,应用CodonCode Aligner v 4.25 对测序峰图进行校对拼接,并去除低质量序列及引物区,得到ITS2 序列。用MEGA 6.0 软件计算物种种内和种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,分析变异位点并构建邻接（NJ）系统聚类树,综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ 系统发育树等进行鉴定分析。结果：葶苈子的基原植物播娘蒿和独行菜的种内最大K2P 遗传距离分别为0.021 和0.010,均小于其与混伪品之间的种间最小K2P 遗传距离;NJ 树结果显示播娘蒿和独行菜各自聚为一支,表现出良好的单系性,均可与混伪品明显区分开。结论：以上几种鉴定方法分析结果表明,ITS2 序列能准确鉴别南北葶苈子药材与混伪品,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

中药材锁阳的ITS2条形码分子鉴定研究

目的：应用DNA条形码技术准确、快速鉴定中药材锁阳及其混伪品。方法：采用试剂盒法提取药材的基因组DNA,PCR扩增其核糖体DNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer 2,ITS2）并进行双向测序,应用CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接,比较ITS2序列的GC含量,采用MEGA 5.0计算种内、种间 Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和构建NJ 系统聚类树进行鉴定分析。结果：锁阳药材的ITS2序列长度为229 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.003,锁阳药材及其混伪品的种间平均K2P遗传距离为0.760,种间最小K2P遗传距离明显大于锁阳种内的最大K2P遗传距离。中药材DNA条形码鉴定系统比对和NJ树鉴定结果均表明ITS2 序列可区分锁阳及其混伪品。结论：ITS2条形码可有效鉴定中药材锁阳及其混伪品,且具有较好的稳定性和准确性,为保障临床安全用药提供了新的技术手段。     

基于ITS2条形码鉴定水红花子及其混伪品

目的:利用ITS2条形码对中药材水红花子及其混伪品进行鉴定研究。方法:为对该中药材进行准确鉴定,共收集71份样本,包含药材正品及其混伪品。通过对样品进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,利用Codon Code Aligner软件进行序列质量评价与拼接,获得ITS2序列。用MEGA软件进行序列比对、变异位点及遗传距离分析,采用最近距离法和构建NJ(邻接)树法来评价ITS2条形码的鉴定能力。结果:水红花子药材基原物种红蓼ITS2序列种内遗传距离为0~0.0124,与其混伪品水蓼、酸模叶蓼以及春蓼的种间遗传距离分别为0.0334~0.0508、0.0688~0.0875、0.0379~0.0467。红蓼种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定水红花子与其混伪品。此外,基于ITS2序列构建的NJ树也可将水红花子及其混伪品明显区分开。结论:ITS2条形码是鉴别水红花子药材的有效工具,可为保障该药材生产投料安全提供新的技术手段。     

基于ITS2条形码鉴别半枝莲及其混伪品

目的:运用Internal Transcribed Spacer 2(ITS2)条形码对半枝莲及其混伪品进行鉴别研究,为该药材的安全用药提供依据。方法:提取样品基因组DNA,对ITS2序列进行PCR扩增和双向测序,所得序列经Codon Code Aligner V5.0.2.0拼接,采用MEGA6.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离。采用最近距离法(Nearest Distance)和构建邻接树(NJ Tree)分析ITS2条形码对半枝莲的鉴定能力。结果:半枝莲ITS2序列种内遗传距离为0~0.008 4,与其混伪品半边莲、韩信草和荔枝草的种间遗传距离分别为0.354 7~0.369 6、0.044 2~0.054 2、0.271 9~0.301 8。半枝莲种内最大遗传距离小于其与混伪品的种间最小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定半枝莲与其混伪品。基于ITS2序列构建的NJ树也可将半枝莲及其混伪品明显区分开。结论:ITS2序列可以快速、准确鉴别半枝莲与其混伪品,是鉴别半枝莲、保障其药材质量的有效条形码。     

种子类药材补骨脂及其混伪品的ITS2条形码序列鉴定

目的:种子类药材补骨脂具有肝肾毒性,其混伪品曼陀罗子、天仙子、洋金花的种子、猪屎豆也含有毒性成分,且补骨脂与其混伪品外形相似,易导致混用误用,严重危害人体健康。本研究利用DNA条形码技术,分析补骨脂及其混伪品的ITS2序列,以期快速准确鉴定补骨脂及其混伪品,保证其用药安全及临床疗效。方法:对补骨脂及其混伪品样品进行DNA提取、PCR扩增ITS2序列,并进行双向测序,所有序列用MEGA6.0软件进行种间、种内Kimura2-parameter(K2P)遗传距离计算,并构建NJ系统聚类树。结果:补骨脂ITS2序列长度为233bp,G+C含量为69.5%,种内无变异位点。补骨脂与其混伪品种间变异位点较多,种间K2P最小距离为0.5321,远远大于其种内距离,NJ树显示可以将补骨脂及其混伪品完全分开。结论:ITS2条形码序列可准确鉴别种子类药材补骨脂及其混伪品,为保证补骨脂的临床用药安全和种质资源鉴定提供了良好的技术手段。     

应用ITS2条形码鉴定藏药镰形棘豆

目的对藏药镰形棘豆及其易混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量及临床疗效。方法提取样本基因组DNA,对核基因ITS2片段进行PCR扩增并测序,并对所得序列进行同源性比较,利用MEGA软件进行相关数据分析,并构建基于ITS2序列的邻接(NJ)树。结果镰形棘豆物种种内K2P遗传距离为0,与其他混伪品的K2P遗传距离分布于0.068~0.084,构建的NJ树表明ITS2序列能够区分镰形棘豆与其他易混伪品。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别镰形棘豆及其易混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

基于ITS2序列的中药材藤梨根DNA分子鉴定

目的：通过DNA条形码鉴定技术区分中药材藤梨根及其常见混伪品。方法：对采集的中药材藤梨根样品及其常见混伪品进行DNA 提取,PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner 3.5.7对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA 5.0软件计算藤梨根及其常见混伪品的Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建NJ（邻接）系统聚类树,最后分析种间ITS2序列的二级结构差异。结果：中药材藤梨根两种基原植物的平均种内K2P遗传距离分别为0.001和0.002,远小于藤梨根与其常见混伪品之间的平均K2P遗传距离0.120;藤梨根与其常见混伪品的ITS2二级结构也存在明显差异;NJ树显示藤梨根的基原植物聚在一起,与混伪品可明显区分,但无法区别所有猕猴桃属植物。结论：ITS2序列可高效区分藤梨根及其常见混伪品,弥补了传统鉴定方法的不足,提高了鉴定效率及准确性。     

基于ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品

该研究应用ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品,以期探索牡丹皮药材准确鉴别的新方法。提取牡丹皮及其混伪品的DNA,目标片段经PCR扩增后测序,通过CodonCode Aligner V3.7.1对测序序列进行质量分析和拼接,基于MEGA 5.0中的K2P模型计算牡丹皮与其混伪品的种内、种间遗传距离及构建系统聚类树。牡丹皮ITS2序列长度为227 bp,种内最大K2P距离为0,它与各混伪品的种间最小K2P距离为0.041,种间平均K2P距离为0.222。由NJ树可知：不同产地来源的牡丹皮药材个体聚为一支,自展支持率为99%,呈现出明显的单系性,能很好地与其混伪品芍药、川赤芍、白鲜皮、朱砂根区分开来。应用ITS2序列可以准确鉴别牡丹皮药材及其混伪品,该方法可以作为传统鉴别方法的有效补充。     

凉茶药材鸡蛋花及其混伪品的DNA条形码鉴定

该研究应用ITS2序列作为DNA条形码鉴定凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,共收集48份药材和基原植物样本,提取基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,经CodonCode Aligner拼接注释获得序列,然后应用MEGA5.0比对ITS2序列,计算种内和种间遗传距离,构建系统进化NJ树进行鉴定。结果表明,鸡蛋花ITS2序列长度为244 bp,种内遗传距离为0~0.016 6,远小于其与混伪物种间的遗传距离0.320 8~0.650 4,NJ树结果显示鸡蛋花与其混伪品均可准确区分。因此,应用ITS2条形码能够准确、有效地鉴别凉茶药材鸡蛋花及其混伪品,为鸡蛋花药材的鉴定提供了一种新的分子手段,为其使用安全提供了有力保障。     

基于ITS2条形码的两面针药材及其混伪品的鉴别

目的 利用ITS2条形码鉴别两面针药材及其混伪品,为两面针药材鉴定提供新方法.方法 采用PCR法扩增ITS2(转录第二间隔区)序列,双向测序后运用CodonCode Aligner、MEGA软件进行数据处理,构建系统聚类树(NJ树).结果 两面针药材及其混伪品基因组DNA降解明显,但不影响ITS2条形码的PCR扩增和测序,ITS2条形码序列分析表明种内与种间遗传距离具有较大差异,基于ITS2条形码构建NJ树可鉴别两面针药材及其混伪品.结论 ITS2条形码适用于两面针药材及其混伪品的鉴别,为两面针药材快速、准确鉴定提供新方法;为两面针基原研究提供重要的分子鉴定证据;同时为DNA条形码技术应用于其他根、茎类中药材的鉴定提供了示范作用.