TaqManTM实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的初步研究

目的：建立实时荧光TaqMan^TM定量检测蜡样芽胞杆菌的快速检测方法，为食品中蜡样芽胞杆菌污染的调查及食物中毒的快速准确定量检测提供手段。方法：通过分析蜡样芽胞杆菌16SrDNA、23SrDNA、16S-23S ITS、gyrB、groEL、cereolysin AB、HBL（hblA、hblC、hblD）、NHE（nheA、nheC、nheD）、bce—T等目的基因，对比所选取的不同目的基因优缺点，最终选择合适的目的基因16S-23SITS进行同源性分析，并根据GenBank公布的蜡样芽胞杆菌16S-23SITS基因的保守序列，用引物与探针专业设计软件自行设计引物和TaqMan^TM探针，并利用硅胶模型^TM 基因组DNA提取法制备DNA标准品，通过对TaqMan^TM实时荧光PCR退火温度、探针浓度、引物浓度、Mg^2＋离子浓度、缓冲液浓度及酶用量等反应条件的优化，初步建立蜡样芽胞杆菌的实时荧光TaqMan^TM,陕速定量检测方法，并利用该方法对模拟样品进行检测。结果：选取的16S-23S ITS基因同源性达到99％以上，特异性好；所有蜡样芽胞杆菌均含有两段16S-23S ITS基因，有利于提高反应的灵敏度。通过对各实验条件的优化，得出蜡样芽胞杆菌TaqMan^TM实时荧光PCR的最佳反应条件，初步建立起实时荧光TaqMan^TM定量检测蜡样芽胞杆菌的快速检测方法，该方法能在3h左右完成整个检测过程。结论：实时荧光TaqMan^TM定量检测法不但灵敏度好，而且特异性高，检测时间短，能提高蜡样芽胞杆菌的检出率和检测准确性，可望应用于蜡样芽胞杆菌食物中毒的快速准确定量诊断。     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

TaqMan-实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌

[目的]建立TaqMan-实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)的方法,用于食物中毒快速诊断和食品中VP的污染状况调查。[方法]根据GenBank公布的VP tdh基因序列,设计引物和探针,建立TaqMan-实时荧光PCR快速检测体系,应用于食品中VP检测。[结果]TaqMan-实时荧光PCR快速检测体系灵敏度为1.3×104cfu/ml(33 cfu/PCR反应体系),特异性好,无交叉反应。[结论]TaqMan-实时荧光PCR检测体系灵敏度高,特异性强,能提高VP的检出率和准确性,可应用于VP食品污染状况调查和食物中毒的快速诊断。     

双重实时荧光PCR快速检测O157大肠杆菌的初步研究

[目的]建立双重实时PCR体系,实现对O157大肠杆菌rfbE和stx2基因的同步检测。[方法]根据GenBank公布的O157大肠杆菌rfbE和stx2基因序列,应用分子生物学软件设计两对引物和TaqMan探针,并对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测O157大肠杆菌的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。[结果]所有O157大肠杆菌菌株的检测结果均为阳性,而所有其他菌株检测结果均为阴性;该方法对O157大肠杆菌纯培养的检测范围为10^0～10^6cfu/μl,重复性检测的变异系数均小于5%。对模拟污染牛奶样本的检测范围为10^2～10^6cfu/μl。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。[结论]基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系可同步检测O157大肠杆菌rfbE和stx2基因,具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于O157大肠杆菌食物中毒的快速诊断和食品微生物检测。     

实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建

[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS重组质粒，为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准。[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS特异基因作为目的靶序列，设计、合成引物和探针，采用普通PCR扩增特异靶序列，克隆到pGM—T载体后，转化感受态大肠埃希菌DH5α，经蓝白斑筛选，再分别用EcoRI酶切，普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组。建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线。[结果]成功构建目的重组质粒，并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线，重组质粒标准具有较大的线性范围（10^2copies／ul～10^8 copies／ul）和灵敏度。[结论]该方法构建的16s-23s ITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求，为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件。     

产毒真菌多重实时荧光PCR快速检测方法建立

目的建立一种能够在单体系中同时检测产黄曲霉毒素真菌及3种潜藏性产毒真菌的多重实时荧光PCR快速检测方法。方法分别根据产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的蛋白活化基因aflR、ITS序列、β-微管蛋白编码区、LS rRNA,设计引物和探针,通过优化反应组分和反应条件,建立了可同时检测常见产毒真菌的实时荧光PCR方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行了分析。结果优化建立的反应体系对产黄曲霉毒素真菌、赭曲霉、青霉和镰刀菌的检测限分别可达到3.37×10⁴、1.91×10⁴、1.53×10⁴和3.95×10⁴拷贝/反应。结论本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可在2 h内完成对产毒真菌的检测。     

实时荧光定量PCR快速检测腺病毒方法的建立与评价

目的建立针对人腺病毒Hexon基因的实时荧光定量Taq Man PCR检测方法,用于腺病毒感染的早期诊断及病毒核酸定量分析。方法根据人腺病毒Hexon基因高度保守区设计引物和Taq Man探针,建立人腺病毒实时荧光定量Taq Man PCR快速检测方法。对方法的灵敏度及特异性进行评价;选取3个浓度的标准品,进行5次重复检测,对方法的重复性进行验证;用该方法对90份临床标本进行检测。结果建立的检测方法对人腺病毒的检测与其它呼吸道病原无交叉反应;检测灵敏度为10拷贝/μl;对103、104、105拷贝/μl 3个浓度标准品分别进行5次重复检测,其Ct值的变异系数均小于5%。对临床90份发热病例的咽拭子标本检测的腺病毒阳性率为90%,与普通PCR检测法的结果(90%)一致;检测准确率达100%。结论本研究建立的Taq Man荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度和重复性均好,适用于人腺病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

实时荧光PCR检测诺瓦克病毒的应用研究

目的应用实时荧光PCR方法对诺瓦克病毒性急性胃肠炎进行快速检测，为疾病预防控制提供准确可靠的实验诊断依据。方法采集一起急性胃肠炎暴发流行患者的1份粪便、5份肛拭和1份呕吐物，进行实时荧光PCR检测。结果实时荧光PCR检测有1份病人粪便和1份病人肛拭样本中诺瓦克病毒核酸呈阳性。结论这是一起由诺瓦克病毒感染引起的急性胃肠炎暴发流行。     

快速荧光法检测沙门氏菌的初步研究

沙门氏菌能引起人类和动物的沙门氏菌病，是细菌腹泻和食物中毒最常见的病原菌，常规培养方法分离和鉴别沙门氏菌操作复杂、费时，经研究发现，４－甲基伞形酮辛脂（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｙｌ－ｃａｐｒｙｌａｔｅ，ＭＵＣ）即ＭＵＣ快速荧光法可快速检测食...     

PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用分析

目的分析PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用,发掘PCR技术的价值和作用。方法采用Taqman探针实时荧光定量PCR技术,针对沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因设计引物和Taqman探针,快速检测沙门氏菌。结果检测沙门氏菌时,PCR技术与传统的检测技术相比,不仅快速,而且准确,具有较高的实用的价值。结论采用PCR技术,有利于实现快速检测沙门氏菌。     

改良分子信标—实时PCR快速检测副溶血弧菌

目的 :建立改良分子信标 -实时 PCR检测副溶血弧菌的快速方法 ,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法 :根据 Gen Bank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因 (TDH)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,用 FAM荧光剂标记探针的 5′,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时 PCR反应体系 ,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果 :检测 12种细菌 ,只有副溶血弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为 16 6 .6 fg/ μl,菌液灵敏度为 6 9cfu/ ml或 6 cfu/ PCR反应体系。改良分子信标 -实时 PCR反应体系检测 4 0株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号 ,无干扰。对 3起细菌性食物中毒共 4 8份样品和 10 0份海产品进行检测 ,9份副溶血弧菌实时 PCR阳性 ,其中 7份副溶血弧菌细菌培养阳性 ,其余样品都为阴性。检测时间仅需 2 h。结论 :改良分子信标 -实时 PCR检测体系快速、灵敏度高 ,特异性强 ,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断 ,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段     

空肠弯曲菌多重PCR快速检测方法建立的研究

[目的]建立一种能够快速检测鉴别样品中的空肠弯曲菌的多重PCR方法。[方法]根据空肠弯曲菌hipO、mapA、23S等基因序列,利用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物,经过优化筛选出最佳引物组合,再对引物的浓度、Mg2 浓度、退火温度等条件进行优化后,建立了从样品中快速检测鉴别空肠弯曲菌的多重PCR方法。[结果]实验结果显示本方法的特异性较强,灵敏度高,达到15 cfu/ml。[结论]多重PCR方法对于样品中空肠弯曲菌的检测实验周期短,灵敏度高,操作简便,适宜推广应用于各卫生单位日常对样品中空肠弯曲菌污染的快速检测。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化

[目的]建立一种快速检测样品中霍乱弧菌的多重PCR方法,优化霍乱弧菌多重PCR的反应体系和循环参数.[方法]根据霍乱毒素ctxA、toxR、O139群特异性基因、O1群特异性基因序列,设计特异性引物,对引物浓度、PCR缓冲液的浓度、Mg2+浓度、退火温度及其延伸时闻等条件进行优化.[结果]4对引物在不同血清型霍乱弧菌DNA模板中能特异扩增出不同的条带.在同一反应体系中,较低的延伸温度可以提高霍乱弧菌多重PCR检测的灵敏度.[结论]通过对霍乱毒素多重PCR反应体系不同因素的优化,建立了稳定可靠的霍乱弧菌多重PCR检测平台.     

免疫磁珠与荧光定量PCR联合检测乳制品中阪崎肠杆菌的实验研究

[目的]建立一种免疫磁珠吸附-荧光定量PCR(IMB-FPCR)快速检测阪崎肠杆菌的方法,探讨在乳制品污染监测及食物中毒快速诊断中的应用。[方法]根据阪崎肠杆菌rpsU-dnaG基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于金黄色色葡萄球菌检测的定量标准品,建立阪崎肠杆菌IMB-FPCR检测方法。[结果]成功构建了阪崎肠杆菌重组质粒标准品和阪崎肠杆菌IMB-FPCR方法。阪崎肠杆菌的免疫磁珠吸附试验显示磁珠对奶粉中的阪崎肠杆菌吸附率达77.7%。通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性,最低检测限为10cfu/ml的菌细胞,并具有良好的稳定性和重复性。整个检测仅需时1d。[结论]IMB-FPCR简便快速、灵敏度高及特异性强,为准确检测乳制品中阪崎肠杆菌提供了一个新的途径,可广泛应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析

目的 了解双重实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌的效果.方法 采集从业人员肛拭子样本,用双重实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌,检出的疑似阳性样本按国标法进行培养鉴定.结果 采用双重实时荧光PCR反应体系共检测从业人员39 974人次,荧光PCR检测出沙门菌阳性41份,阳性率1.22‰,培养法检测出31份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.95％.荧光PCR检测出志贺菌10份,阳性率为0.25‰,培养法检测出3份,阳性率为0.08‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.98％.从样品处理到检测结果仅需要时间2h～ld.结论 双重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于从业人员体检的快速诊断和肠道传染病的初筛,为肠道传染病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

基因探针法快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

[目的]应用Accuprobe基因探针方法快速检测食品中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。[方法]本实验针对基因探针法检测金葡菌的特异性、敏感性、准确性进行研究，比较该方法与传统国标法的检测结果。[结果]基因探针方法检测食品中金葡菌特异性强，采用增菌肉汤的检测低限为107cUfnJ，检测金葡菌的结果与国标法相一致；对食品中金葡菌鉴定时间仅需30min，简便快捷。[结论]基因探针方法可用于食品中金葡菌的快速检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

聚合酶链反应检测门诊STD患者泌尿生殖道EB病毒感染的实验研究

[目的]了解四川泸州地区门诊STD患者泌尿生殖道感染EB病毒情况。[方法]采用聚合酶链反应（PCR）方法检测868例门诊STD患者泌尿生殖道EB病毒。[结果]在868例患者中,有192例被检出感染了EB病毒,阳性率为22.12%（192/868）;其中单纯感染EB病毒者34例,占17.71%（34/192）;混合感染者158例,占82.29%（158/192）。[结论]PCR检测技术具有简便、快捷、准确、特异性强的特点,其检测的结果可以作为临床诊断泌尿生殖道感染EB病毒的可靠依据,有较高的临床实用价值。