水提取法和仿生提取法研究菲牛蛭不同炮制品的体外抗凝活性

目的:采取不同的提取方法研究菲牛蛭炮制前后抗凝活性变化。方法:分别采用水提取法及模拟胃肠道环境的仿生提取法提取菲牛蛭活体冻干品、清水吊干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的活性成分,测定活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、抗凝血酶活性4个凝血指标,并采用Lorry法测定其蛋白含量,综合评价2种提取方法下的菲牛蛭及其炮制品的抗凝活性。结果:无论是水提取法,还是仿生提取法,APTT、PT、TT均显示炮制后抗凝活性降低,抗凝活性顺序为活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品,此结果与抗凝血酶活性及蛋白含量顺序一致。结论:高温炮制方法会降低菲牛蛭的抗凝活性。     

不同提取法炮制对水蛭体外溶栓活性的影响

目的:研究炮制对水蛭体外溶栓活性的影响。方法:采用水提取法和仿生提取法对水蛭净制品、烫制品、酒制品进行提取,选用纤维蛋白平板法和纤维蛋白原平板法,以平板上透明圈面积为指标进行纤溶活性测定;并建立体外血栓模型,通过血凝块的失重比进一步评价水蛭不同炮制品的溶栓活性。结果:水蛭在炮制前后均能在纤维蛋白平板上产生透明圈。采用水提取法时,烫制品和酒制品的溶圈面积减小,炮制后纤溶活性降低,活性顺序为:净制品酒制品烫制品。而采用仿生提取法时,显示烫制和酒制后水蛭纤溶活性升高,活性顺序为:烫制品酒制品净制品。体外血栓模型中,血凝块失重比结果与纤溶活性测定结果一致,采取水提取法时,炮制使溶栓活性降低,而采用仿生提取法时显示炮制使溶栓活性增加。结论:与水提取法比较,仿生提取法更符合水蛭经口服后在人体内的消化吸收过程,其结果更有说服力。传统炮制可增强水蛭溶栓活性。     

水蛭不同炮制品抗凝血活性的比较

目的:应用抗凝血活性指标筛选水蛭炮制工艺。方法:按生物检定法测定各种炮制品水提取物的抗凝血时间,比较不同炮制方法对水蛭抗凝血活性的影响。结果:净制法和低温冷冻粉碎炮制法均能较好地保持水蛭抗凝血活性,而其它炮制方法炮制的水蛭抗凝血活性不强。结论:净制法炮制水蛭,能较好地保持抗凝血活性,且制作简便,是一种较好的炮制方法。     

水蛭不同炮制品质量比较

水蛭系破血逐瘀类中药,《全国中药炮制规范》规定其以炮制品入药。本文对水蛭生品及其各种炮制品游离氨基酸、水溶物和醇溶物含量进行了分析,为评价其质量提供了依据。1 样品制备 水蛭购于安国药材市场,经鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman的干燥全体。     

不同因素及给药途径对水蛭制剂抗凝活性的影响

实验结果表明,pH、温度、有机溶剂以及不同的给药途径都将影响水蛭制剂的活性效价。为充分发挥水蛭活性物质作用,在制剂的制备工艺和给药途径上均要考虑其合理性。     

水蛭及其炮制品中氨基酸的分析

<正> 水蛭为破血逐瘀、通经消癥之中药,有关其生品中氨基酸种类和含量已有报道,但对炮制前后有关氨基酸的变化尚未见有报道。为此,我们对日本医蛭及其炮制品中氨基酸进行了分析     

水蛭不同提取物抗凝活性的体外实验研究

目的:研究水蛭不同提取物的抗凝活性,为水蛭的新药开发提供实验依据.方法:Wistar大鼠腹静脉取血,应用血凝仪体外测定凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化的部分凝血活酶时间(APTT).结果:水蛭的乙酸乙酯部分能使大鼠的PT、TT、APTT显著延长.正己烷部分、水溶液部分能使大鼠的PT显著延长,正丁醇部分能使大鼠的APTT显著延长.结论:水蛭各提取物均有抗凝活性,水蛭中存在不同于水蛭素的新的抗凝血成分.     

水蛭抗凝血活性物质提取工艺研究概况

中药水蛭在临床过程中被广泛应用于心脑血管疾病的治疗,在中成药中多以原粉入药。现就水蛭抗凝血活性物质的提取方法进行综述,对水蛭的提取工艺加以总结,以利于在制剂工艺中对不同品种、不同状态的水蛭,优选出最佳的提取工艺。     

重组水蛭素体内抗凝活性的实验研究

目的：研究重组水蛭素的抗凝活性,为水蛭素新药开发提高实验依据,方法：家兔iv重组水蛭素前及后心脏采血,应用血凝仪测定凝血酶时间（TT）,凝血酶原时间（PT）,和活化的部分凝血活酶时间（APTT）,并考察其抗凝活性的量效和时效关系。结果：重组水蛭素能明显延长TT和APTT,且呈剂量依赖性,但在所试剂量范围内对PT无明显影响,其延长TT和APTT的作用随时间而下降,作用持续约60min,结论：重组水蛭 素具有明显抗凝作用,明显强于现有抗凝药肝素,且其作用强度与同剂量德国产基因重组水蛭素Refludan相同。     

水蛭抗凝活性检测两种滴定方法比较

目的:比较药典标准凝血酶滴定法和白瓷板法对中药水蛭抗凝活性检测结果的影响。方法:分别采用《中国药典》中凝血酶滴定法和云南省《菲牛蛭冻干粉中药饮片炮制规范征求意见稿》中白瓷板法对水蛭抗凝活性进行多次平行滴定实验。结果:抗凝活性成分含量较高的菲牛蛭其药典法滴定结果重复性更稳定,白瓷板滴定法结果的重复性会随着单次进样量减少而趋于稳定;宽体金线蛭的抗凝活性结果在两种方法的对比检测下均较为稳定。结论:对于吸血水蛭品种抗凝活性的测量,建议保留原凝血酶滴定法;对于抗凝活性较低,实验中凝血酶溶液浓度较小的水蛭品种,两种滴定法均适用,也可同时应用互相验证。另在滴定操作中,将反应试管改换成玻璃液相进样瓶,且在滴定动作后将反应容器呈一定角度倾斜放置,有助于对反应终点进行判断,提高实验结果的准确性和稳定性。     

水蛭的化学成分研究

[目的]研究中药水蛭的化学成分。[方法]采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20等色谱方法进行分离纯化,依据理化性质及波谱数据进行结构鉴定。[结果]从中药水蛭的95%乙醇提取物中分离得到9个化合物,分别鉴定为:吲哚-3-甲酸-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、3-吲哚-甲醛(2)、腺苷(3)、2-羟基嘌呤核苷(4)、尿嘧啶核苷(5)、腺嘌呤(6)、尿嘧啶(7)、黄嘌呤(8)和2-哌啶酮(9)。[结论]首次从该药材中分离得到9种化合物。     

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的：采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法：利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果：经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为–427.506 kJ·mol^–1。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论：利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,...     

不同光质对蚂蟥生长和内在品质影响的研究

50 d实验期内,比较红光(610±10)nm、蓝光(450±10)nm、白光(全光谱)和自然光(full spectrum)对30日龄蚂蟥生长和内在品质的影响。结果表明:30~40日龄期间,蓝光对蚂蟥的促生长作用最强,红光组和白光组在50 d后表现出明显的促进蚂蟥生长的优势,红光和白光最终质量显著高于蓝光和自然光(P0.05);红光下蚂蟥特定生长率(SGR)、增重率、消化酶活力均高于其他各组(P0.05);白光下蚂蟥SOD,CAT,ALP酶活性最高,与其他各组相比有显著差异(P0.05);不同光质对蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、p H和抗凝血酶活性影响不显著。蚂蟥50日龄后,红光下消化酶活性最高且生长最快,白光下抗逆酶活性最高,光质对蚂蟥内在品质无显著影响。     

不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长和内在品质影响的研究

采用生物量测定、3,5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法等方法研究不同养殖密度和换水频率对蚂蟥生长、消化酶活性、生化指标和内在品质的影响。结果表明:蚂蟥的最终质量,特定生长率(SGR),增重率(WGR),淀粉酶,脂肪酶,蛋白酶活力,SOD,CAT,ALP酶活性与密度呈反比,与换水频率呈正比(P0.05);换水频率与水中氨氮、亚硝酸盐和硫化氢呈负相关,与溶氧量呈正相关;养殖密度和换水频率对蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、p H和抗凝血酶活性影响不显著。因此,每亩50万条为较适宜的养殖密度,每72 h 1次为较适宜的换水频率。     

蚂蟥与螺蛳耗氧率、窒息点相关性及最适投喂方式的研究

采用静水呼吸室法测定不同质量蚂蟥和螺蛳的耗氧量、耗氧率和窒息点,生物量测定法研究不同投喂方式对蚂蟥生长的影响。结果表明:25℃条件下,蚂蟥和螺蛳耗氧量与质量呈正相关(P0.05),窒息点随质量增大而增大(P0.05)。蚂蟥耗氧率与质量呈负相关,螺蛳耗氧率随质量增大呈先增大后减小趋势。投喂方式对蚂蟥终末质量、SGR,WGR和死亡率影响不显著,对进食比例影响显著(P0.05)。蚂蟥最适投喂频率为3 d投喂1次,应根据蚂蟥和螺蛳各阶段耗氧量及窒息点,结合养殖密度、水体面积以及换水频率,科学合理计算出螺蛳的投喂量。     

蚂蟥冬眠临界温度的研究

采用生物学观测法、静水法、3,5-二硝基水杨酸比色法、对棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法观测和测定不同温度下蚂蟥生物学特征、耗氧量、耗氧率、消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性。结果表明,随着温度的降低,蚂蟥活动减弱、进食减少,4℃后不食不动,头部和尾部弯曲呈"弯月"状;耗氧量、耗氧率以及消化道酶活性随温度下降逐渐下降,10℃后下降趋势减缓,4℃后趋于稳定,不随温度降低而变化;在4℃状态40 d过程中,淀粉酶变化不显著,脂肪酶、蛋白酶活性在20d时有所降低,其中脂肪酶下降后又轻微上升后保持较低水平。结论,4℃为蚂蟥冬眠的临界温度,"弯月"状可作为其冬眠状态的标志。     

不同月龄蚂蟥消化酶活性的研究

采用3,5-二硝基水杨酸比色法、对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法探究0~6月龄蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活力变化规律。结果表明,蛋白酶比活力1.5月龄前维持在较低水平, 2月龄活性最高,碱性蛋白酶 4月龄呈现一小峰值后快速下降;淀粉酶出生时活力较低,之后逐渐升高,2.5月龄活性最大;脂肪酶刚出生时便有较强活力,1月龄最低,2月龄达到峰值,4月龄又出现一小峰值。综上所述,蚂蟥出生时仅脂肪酶呈现较强活力,脂肪酶在消化道发育过程中比活力最强,蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶在2~3月龄时活力均最强,4月龄后均呈下降趋势。     

蚂蟥酶解工艺研究

目的确定蚂蟥的最佳酶解工艺。方法选取活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)3种抗凝活性指标,以外翻肠囊实验筛选蚂蟥酶解物在肠吸收前后最佳活性测定指标。采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、复合酶(先胃蛋白酶后胰蛋白酶)对蚂蟥进行酶解,以筛选得到的最佳活性指标考察酶的种类、酶底比、酶解时间以及酶解温度对蚂蟥酶解工艺的影响。结果 TT是测定蚂蟥酶解物抗凝活性的最佳指标,采用胰蛋白酶对蚂蟥酶解可获得高活性的酶解产物,最佳的酶解条件为温度73℃,酶底比10%,酶解时间8 h。结论 TT作为抗凝指标进行酶解工艺考察,可反映整个凝血过程,结果更可靠,且该法操作简便,灵敏度高。所优选的酶解工艺简单可行,可为蚂蟥合理提取提供依据。     

宽体金线蛭仿生酶解液物质基础分析

目的 对宽体金线蛭仿生酶解液进行物质基础分析。方法 采用化学定性和定量的方法,对固形物、无机盐、肽、氨基酸等物质进行含量测定,并进行核苷特征图谱及肽特征图谱研究。结果 通过对15批宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱研究,确定固形物、无机盐、肽、游离氨基酸、总氨基酸的质量浓度分别为75.5～79.7、10.7～12.7、42.6～49.4、1.9～3.1、49.4～51.6 mg·mL^–1。建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱,共标定和归属了4个特征峰;建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱,共标定6个特征峰。结论 建立了宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱的研究方法,简便快捷、重复性好,可用于对其进行质量控制。     

精氨酸对蚂蟥诱食效应的初步研究

以蚂蟥Whitmania pigra为试验动物,在排除振动、底物影响的前提下,以黄原胶作为饲料底物,观察不同浓度精氨酸对蚂蟥的诱食效应。结果表明,0.3%精氨酸对蚂蟥有明显的诱食作用,与蚂蟥天然饲料螺蛳体液中精氨酸质量分数2.97 mg·g-1相接近。