EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建

①目的 构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体.凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向.③结果 以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的 基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体.④结论 成功地构建真核表达载体.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.     

EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响

目的:了解EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:构建pSG5/BARF1真核表达载体,转染到EB病毒阴性的胃癌细胞系SGC7901,经RT-PCR鉴定,获得BARF1稳定表达的细胞克隆.以pSG5空载体转染细胞为对照,进行细胞凋亡诱导实验、细胞增殖实验、软琼脂集落形成实验和细胞迁移实验.结果:与对照组相比,BARF1表达细胞组经抗癌药顺铂诱导后的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),增殖速度显著加快(P<0.01),软琼脂集落形成率显著提高(P<0.05),细胞迁移能力显著增强(P<0.05).结论:BARF1基因能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性,可能在EB病毒相关胃癌发生与演化的整个过程中起重要作用.     

EB病毒BARF1基因对人胃上皮细胞恶性转化的作用

目的 探讨EB病毒编码BARF1基因在人胃上皮细胞恶性转化中的作用.方法 用携带BARF1基因的真核载体PIRES2-EGFP/BARF1,转染人胃上皮细胞系GES-1,通过G418筛选,获得稳定表达BARF1基因的人胃上皮细胞株.GES-1细胞被分为4组,包括1个转染BARF1基因的细胞组,1个转染BARF1基因并...     

EB病毒转化人胃上皮细胞GES-1中bcl-2基因的表达

目的 研究EBV感染人胃上皮细胞系GES-1后bcl-2基因的表达状况,探讨6cl-2基因在EBV相关胃癌发生中所起的作用.方法 采用携带新霉素抗性(NEOr)基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,经有限稀释法克隆和G418筛选获得感染和转染细胞克隆,用pcDNA3空载体质粒转染的人胃上皮细胞系GES-1细胞作对照:采用免疫细胞化学染色(ICC)法测定EBNA1基因的表达以鉴定EBV感染细胞克隆及测定EBV感染细胞中Bcl-2蛋白的表达.结果 与对照相比较,感染细胞中Bcl-2蛋白的表达阳性.结论 EBV感染可使人胃上皮细胞Bcl-2蛋白表达增高,EBv对人胃上皮细胞的转化作用可能与bcl-2基因的过度表达有关.     

TGF-β1参与调控LMP1介导信号转导通路的研究

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和EB病毒(EBV)潜伏期膜蛋白1(LMP1)在EBV相关胃癌发生中的作用及其机制。方法设计合成靶向LMP1的siRNA649转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,并与TGF-β1联合作用,RT-PCR检测LMP1沉默和TGF-β1作用对LMP1介导的信号转导通路相关因子转录表达的影响。结果与细胞对照和脂质体对照比较,siRNA649、siRNA649+TGF-β1分别作用GT38细胞系后,基质金属蛋白酶9(MMP9)、生存素(Survivin)和细胞黏附分子1(ICAM-1)表达降低,而细胞周期依赖性激酶4(CDK4)表达升高,差异均有显著性(F=10.48～26.23,P<0.05);siRNA649+TGF-β1联合作用后表皮生长因子受体(EGFR)表达水平显著高于对照组(F=9.47,P<0.05),而siRNA649组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。TGF-β1作用EBV阳性细胞系(GT38和SNU719)和EBV阴性细胞系(SGC7901和HGC-27),与对照组相比GT38细胞中ICAM-1表达显著降低,差异有显著性(F=30.36,P<0.05),其他细胞中ICAM-1的表达差异无显著性(P>0.05);4种细胞系TGF-β1作用前后MMP9、Survivin、CDK4和EGFRmRNA转录表达差异均无显著意义(P>0.05)。结论 LMP1可以调控MMP9、Survivin和CDK4表达,LMP1与TGF-β1相互作用可调控ICAM-1和EGFR的转录表达。     

鼻咽癌细胞EB病毒编码BHRF1基因的研究

利用斑点杂交技术检测正常鼻咽青草 咽未分化癌、低分化及高分化鳞癌中ＥＢ病毒编码ＢＨＲＦ１基因的存在情况。结果表明，鼻咽未分化癌及低分化鳞癌中的ＢＨＲＦ１阳性率分别为９０％和８５．７％，而高分化鼻咽癌组织的阳性率为２５％。提示ＢＨＲＦ１基因可能与因癌细胞的分化有关。     

EB病毒对胃癌细胞增殖、凋亡和脂代谢的影响

【目的】探讨EB病毒（EBV）对胃癌细胞增殖、凋亡及脂代谢的影响,以揭示EB病毒相关胃癌（EBVaGC）发生发展的机制。【方法】将AGS和A kata细胞共培养建立EB病毒阳性的AGS-EBV细胞株,并比较AGS和AGS-EBV细胞增殖、凋亡和脂代谢的变化。使用CCK-8测定法检测细胞增殖活性,Annexin V PE/7-AAD凋亡染色和流式细胞术检测细胞凋亡。油红O染色观察胃癌细胞内脂滴的含量,并用相关脂质试剂盒检测游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇的含量,qRT-PCR检测脂质合成关键酶的表达。【结果】EB病毒促进胃癌细胞株AGS细胞增殖（F=23.214,P=0.001;24、48、72、96和120h的P值分别为0.007、0.004、＜0.001、＜0.001和＜0.001）,抑制细胞凋亡（晚期和总凋亡率的P值分别为0.032和<0.001）,并可能通过上调脂质合成酶表达而使细胞内脂滴、游离脂肪酸（P<0.001）、甘油三酯（P=0.004）和总胆固醇（P<0.001）含量增加。【结论】EB病毒促进胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡,并增强细胞脂代谢。     

鼻咽上皮细胞中过表达PIN1 激活JNK信号通路上调CyclinD1的研究

目的：研究肽脯氨酰异构酶PIN1（prolylisomerase,PIN1）可能影响的肿瘤信号通路和相关基因,探讨鼻咽癌早期发生发展的机制。方法：运用慢病毒表达系统在鼻咽上皮细胞系 NP69 中建立PIN1 过表达细胞克隆株,real-time PCR、Western blot检测PIN1表达情况;肿瘤信号通路阵列荧光素酶实验筛选PIN1可能影响的细胞信号通路,Western blot加以验证。结果：稳定表达 PIN1 的NP69 细胞可激活一系列肿瘤信号通路其中激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK/c-Jun氨基末端激酶JNK（MAPK/JNK） 信号通路,差异具有统计学意义（P<0.01）,核转录因子－κB（P=0.036）、癌基因Myc（P=0.048）信号通路变化具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示与对照组相比,稳定表达 PIN1 的NP69实验组可明显上调JNK 信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-JunSer73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白CyclinD1（t=-7.295,P=0.002）的表达。结论：稳定表达 PIN1 的NP69 细胞可激活MAPK/JNK信号通路,明显上调JNK 信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-JunSer73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白CyclinD1的表达,PIN1与鼻咽癌早期的发生发展密切相关。     

胃癌组织中EB病毒感染与Bcl-2基因表达关系研究

①目的　探讨胃癌组织中EB病毒(EBV)感染与Bcl-2基因表达间的关系,分析Bcl-2在与EBV相关胃癌发生中的作 用。②方法　经EBNA1PCR检测为EBV阳性的胃癌组织标本14例,同时随机抽取EBV阴性胃癌病例19例,以免疫组织化学法分析 Bcl-2蛋白表达,对其结果进行定性分析。③结果　EBV阳性和阴性胃癌组织中Bcl-2检测的阳性率分别为28.6%和26.3%,差异 无统计学意义(P>0.05)。④结论　胃癌组织中EBV感染与Bcl-2基因的表达无关。     

年轻人霍奇金淋巴瘤亚型特点及肿瘤细胞EB病毒和Bcl-2蛋白的表达及其意义

目的:研究EB病毒(EBV)与Bcl-2蛋白在年轻人霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞中的表达,阐明二者之间的关系.方法:复查48例16～36岁霍奇金淋巴瘤患者的临床和病理资料,应用免疫组织化学方法检测肿瘤细胞中CD30、CD15、CD45、LMP-1和Bcl-2蛋白的表达并进行组织学分型;采用组织芯片的原位杂交方法检测EBV的表达...     

褪黑素通过JNK/c-Jun信号通路抑制胆汁酸诱导Cxcl2表达的机制研究

目的 研究褪黑素抑制胆汁酸诱导趋化因子Cxcl2表达的分子调控机制.方法 喂养小鼠含有1％胆酸(cholic acid,CA)的饲料2周,构建胆汁淤积小鼠模型,给予褪黑素腹腔注射(100 mg/kg,1次/d).收集肝组织后HE染色,根据Scheuer系统进行病理组织学评分.采用Real-time qPCR及Weste...     

SAPK/JNK信号通路在鼻咽癌放疗群集耐受中的作用研究

目的 用CNE-2Z多细胞球(multicellular spheroids,MCSs)模拟实体瘤,探讨SAPK/JNK信号通路在鼻咽癌放疗群集耐受中的作用.方法 采用liquid overlay技术进行MCSs培养,Western blot法检测X射线照射后信号通路活性变化,SAPK/JNK信号通路特异阻断剂sp-600125作用前后Caspase-3蛋白表达变化;TUNEL法检测sp-600125作用前后、X射线照射后MCSs凋亡率变化.结果 X射线照射后MCSs中SAPK/JNK信号通路表现动态磷酸化过程,其中2h磷酸化水平最高;预先阻断信号通路X射线照射后,细胞凋亡率上调(P＜0.05),caspase-3蛋白表达增高(P＜0.05).结论 SAPK/JNK信号通路短暂激活可能传递生存信号而在鼻咽癌放疗群集耐受中发挥作用,特异性阻断其信号传递上调MCSs凋亡率,这可能与促进caspase-3蛋白表达有关.     

JNK通路介导LPS诱导脐静脉内皮细胞PD—L1表达的实验研究

目的探讨脂多糖（LPS）刺激脐静脉内皮细胞表达程序性死亡因子配体1（PD—L1）与C—JUN氨基末端激酶（JNK）信号通路的关系。方法体外培养脐静脉内皮细胞,按2x107／m1种植在6孔培养板中,在无血清培养基中静止24h后随机分成阴性对照组、LPS组及SP600125＋LPS组,其中阴性对照组不加干预因素;LPS组先用DMSO（0．1％V／V）作用1h,再用LPS（1．0}xg／m1）刺激24h;SP600125＋LPS组先用SP600125（20μmol／L）作用1h后再用LPS刺激24h,Western．blot测定各组PD．L1及P．JNK蛋白表达。结果SP600125＋LPS组PD—L1蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）;而SP600125＋LPS组和对照组PD．L1蛋白表达与LPS组比较均明显减少,差异均有统计学意义（P〈0．05）。SP600125＋LPS组细胞P．JNK蛋白表达与对照组和LPs组比较均减少,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论LPS可能通过JNK信号通路调控脐静脉内皮细胞表达PD．L1。     

Bcl-2/Bid在胃癌的差异性表达与临床意义

目的 研究B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene,Bcl-2)和促细胞凋亡成员Bid(BH3交叉域死亡受体激动剂,BH3-interacting domain death agonis,Bid)在胃癌及切缘组织中的表达,以探讨其与胃癌发生发展的关系.方法 应用免疫组织化学SP法检测42例胃癌及切缘上皮组织中Bcl-2和Bid的表达.结果 胃癌中Bcl2的阳性表达率(69.05％)明显高于胃切缘上皮组织(21.43％)(P＜0.05),Bcl-2表达水平与胃癌患者的年龄、性别和浸润深度无关(P＞0.05),而与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P＜0.05);胃癌中Bid的阳性表达率(26.19％)明显低于胃切缘上皮组织(76.19％)(P＜0.05),Bid表达水平与胃癌患者的年龄和性别无关(P＞0.05),而与肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关(P＜0.05);Bcl-2和Bid在42例胃癌组织中的表达呈负相关(rs=-0.483,P＜0.05).结论 胃癌组织中Bcl-2蛋白表达上调,Bid蛋白表达下调,共同参与胃癌的发生发展;二者可能是胃癌侵袭、转移、演进和预后的生物学指标.     

MAPK-ERK1/2信号通路调控成骨性基因表达和细胞增殖

目的观察在不同浓度大鼠血清作用下,激活或抑制MAPK-ERK1/2信号通路对大鼠成骨细胞的成骨性基因表达和增殖
的影响。方法原代培养大鼠成骨细胞,进行形态和碱性磷酸酶初步鉴定后,分别用1%和5%的大鼠血清进行培养24 h,WB检
测MAPK-ERK1/2信号通路蛋白p-ERK1/2和ERK1/2表达,同时检测成骨性基因（Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶）和增殖蛋白
PCNA的表达;MAPK-ERK1/2信号通路阻断剂PD0325901抑制P-ERK1/2的表达后观察对Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶和增
殖蛋白PCNA的表达。结果5%大鼠血清激活p-ERK1/2水平明显高于1%大鼠血清（P<0.05）,在MAPK-ERK1/2高水平激活状
态下,成骨性基因如Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达水平出现显著的增加及促进PCNA的表达;当抑制MAPK-ERK1/2
信号通路时,成骨性基因Runx2、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶的表达水平也随之下调,且PCNA 表达也受到抑制。结论激活
MAPK-ERK1/2通路促进成骨基因表达和成骨细胞增殖,抑制此通路将抑制成骨性基因表达和细胞增殖,此通路可能作为治疗
骨质疏松症的药物靶点。
     

下调FoxM1通过激活JNK/线粒体通路增加人鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性

目的 探讨特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 沉默转录因子叉头框M1(FoxM1) 对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖、凋亡、紫杉醇敏感性的影响及可能的分子机制.方法 采用siRNA靶向沉默鼻咽癌HONE-1细胞FoxM1表达并通过RT-PCR、实时定量PCR、Western blot检测转染后FoxM1的表达水平.siRNA转染后细胞的增殖和对紫杉醇的敏感性采用MTT法检测,流式细胞仪检测细胞周期分布,Annexin V-FITC /PI双染法检测细胞凋亡率.Western blot检测Ki67、CyclinE1、多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1) 及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 、p-JNK、 c-Jun、p-c-Jun、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平.结果 转染后FoxM1 mRNA及蛋白的表达均被下调(P＜0. 01) .siRNA转染组细胞增殖速率减缓(P＜0. 05),Ki67表达降低(P＜0. 05) .siRNA转染组G1期细胞比例增加(P＜0. 01),S期比例减低(P＜0. 05),Cyclin E1低表达(P＜0. 01) .同时, siRNA +紫杉醇组凋亡率明显高于阴性及空白对照+ 紫杉醇组(P＜0. 01) .siRNA转染组细胞MDR1水平下降(P＜0. 05),对紫杉醇的敏感性较两对照组明显增强(P＜0. 01) .siRNA + 紫杉醇组与阴性对照+ 紫杉醇组相比p-JNK1、p-c-Jun、Bax表达上调(P＜0. 01),Bcl-2表达下调(P＜0. 01) .结论 特异性siRNA沉默FoxM1表达可以影响JNK/线粒体通路活性,抑制鼻咽癌HONE-1细胞增殖,促进其凋亡,提高其对紫杉醇的敏感性.     

Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1 induces TRAF1 expression to promote anti-apoptosis activity via NF-κB signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma

Objectives To identify whether Epstein-Barr virus (EBV) encoded latent membrane protein 1(LMP1) can induce tumor necrosis factor receptor-associated factor 1 (TRAF1) expression and promote its anti-apoptosis activity via the NF-KB signaling pathway, and assess that LMP1 suppresses apoptosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods A stable transfected cell line HNE2-LMP1 was established by introducing LMP1 cDNA into HNE2 cells. Transactivation of TRAF1 was determined by luciferase reporter assay, while expression of TRAF1 mRNA was detected by RT-PCR and expression of TRAF1 protein and caspase 3 by Western blot analysis. Apoptosis activity was observed through fluorescence staining.Results LMP1 induced TRAF1 expression in NPC cells and caused a decrease in apoptosis. This induction could be blocked by antisense LMPI. Moreover, LMPl-mediated induction of a TRAF1 promoter-driven reporter gene was significantly impaired when the KB site KB1 or KB5 was disrupted,whereas mutation of κB3 had only a minor effect on LMP1 dependent up-regulation of the reporter gene.Conclusion LMP1 induces TRAF1 expression and promotes its anti-apoptosis activity via the NF-κB signaling pathway, which may be one of the mechanisms that LMP1 uses to suppress apoptosis in NPC cells.