碱性成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白2在牙源性细胞分化中的表达及意义

目的研究人牙髓细胞(DPCs)和牙周韧带细胞(PDLCs)矿化过程中碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)和骨形成蛋白2(BMP2)的表达变化,以及FGF2和BMP2在牙髓牙周损伤修复动物模型中的分布,探讨FGF和BMP信号通路在DPCs和PDLCs向成牙本质/成骨样细胞分化及牙髓牙周组织损伤修复中的调控作用。方法酶消化法分离培养DPCs和PDLCs,取诱导前及矿化诱导14d的DPCs和PDLCs,实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测FGF2和BMP2的表达变化并进行统计学分析。建立大鼠牙髓牙周联合损伤动物模型,HE染色观察4周后牙髓牙本质复合体及牙周组织修复情况,免疫荧光检测FGF2和BMP2在新生牙髓及牙周组织的表达和分布。结果 DPCs和PDLCs经矿化诱导,FGF2mRNA表达下调,BMP2mRNA表达上调,与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光示FGF2在新生的牙周韧带组织强表达,在新生牙髓及正常牙髓牙周组织弱表达,BMP2蛋白在损伤处的新生牙髓及牙周韧带组织细胞浆强表达,FGF2和BMP2在正常牙髓及牙周韧带组织均无表达。结论 FGF2和BMP2在DPCs和PDLCs体外成牙本质/成骨分化中可能具备独立的生物学功能,在体内牙齿损伤修复过程中可能存在协同调控作用。     

Notch信号通路参与BMP-6对人牙髓细胞增殖分化作用的研究

目的:本研究通过观察骨形成蛋白-6(BMP-6,bone morphogenetic protein-6)对人牙髓细胞(hDPCs,humandentalpulp cells)增殖和成牙本质向分化的影响,以及Notch信号在其中可能的作用,初步探讨骨形成蛋白-6在牙髓损伤修复中的作用与机制。方法:采用组织块酶消化法体外培养hDPCs,分别应用BMP-6和γ-分泌酶抑制剂DAPT单独或共处理第3-5代hDPCs,采用CCK8法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP,alkalinephosphatase)试剂盒检测ALP活性,茜素红染色法检测矿化结节形成情况,观察牙髓细胞的增殖及成牙本质向分化能力。结果:CCK8结果显示,BMP-6促进hDPCs增殖,DAPT抑制hDPCs增殖,而经DAPT预处理的hDPCs,BMP-6对其促增殖作用减弱,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05);ALP结果显示,BMP-6可促进hDPCs的ALP活性,DAPT则明显抑制其ALP活性,与对照组相比均具有统计学差异(P<0.05),且DAPT可减弱BMP-6对细胞ALP活性的增强作用,与BMP-6组比较具有统计学差异(P<0.05);茜素红染色结果显示,BMP-6处理组矿化结节数量最多,BMP-6和DAPT共处理组次之,DAP7处理组最少。结论:BMP-6可促进hDPCs增殖和成牙本质向分化能力,而阻断Notch信号,可抑制BMP-6对hDPCs的促增殖及促成牙本质向分化作用。     

牙髓组织损伤修复的机制

牙髓组织具有修复潜能,其损伤修复机制目前尚不搞清楚。本文从细胞学和分子学水平对牙髓损修复的机理进行了回顾。     

Notch 1信号蛋白在早期牙髓损伤修复中表达的免疫组化研究

目的 :通过建立大鼠牙髓损伤动物模型 ,观察Notch1信号蛋白在牙髓损伤修复过程中的表达。方法 :在大鼠第一磨牙牙合面开髓 ,分别对损伤后 2h、12h、2 4h、3d、7d及正常大鼠牙髓标本进行HE染色、免疫组化染色 ,检测各组标本中Notch1信号的表达。结果 :Notch1信号蛋白在正常成年大鼠牙髓组织中无表达 ,在牙髓损伤后表达上调。牙髓损伤 12h ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质中呈弱阳性表达。损伤后 1～ 3d ,Notch1在成牙本质细胞层、部分牙髓细胞间质及接近损伤部位的牙髓细胞中呈阳性着色。损伤后 7d ,Notch1的表达位于成牙本质细胞层和穿髓孔下方的细胞增殖层。结论 :Notch1信号蛋白在大鼠牙髓损伤后早期阶段表达逐渐上调 ,随后在成牙本质细胞区及富细胞区牙髓细胞中表达增强 ,并沉积于穿髓点附近的细胞增殖层。提示它可能在牙髓损伤的早期自身修复和牙本质矿化中起作用     

Notch信号通路在牙髓干细胞增殖和分化中的调控作用

Notch信号通路是进化过程中高度保守的信号转导机制,通过细胞与细胞间的相互作用控制细胞的命运。牙髓干细胞是一种具有高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞,在组织再生中发挥重要作用。该文就该信号通路的组成及其对牙髓干细胞调控的分子机制作一综述。     

生长因子在牙髓损伤修复中的作用

生长因子在组织的损伤修复过程中起着十分重要的作用。本文回顾了与牙髓、牙本质损伤修复有关的几种生长因子的生物学效应以及它们在牙髓生物学领域的研究现状。     

牙髓组织损伤修复的机制

牙髓组织具有修复潜能,其损伤修复机制目前尚不搞清楚。本文从细胞学和分子学水平对牙髓损伤修复的机理进行了回顾。     

Notch信号通路对大鼠牙囊细胞增殖和成骨分化的调控作用

目的 探讨Notch信号通路对大鼠牙囊细胞(rDFCs)增殖和成骨分化的调控作用.方法 体外培养rDFCs,经细胞形态、免疫组化鉴定rDFCs后,使用10 ng/L大鼠重组Jagged1蛋白、10μmol/L DAPT溶液、对照组培养液作用于细胞,CCK-8检测增殖能力;利用碱性磷酸酶、茜素红染色分析rDFCs成骨分化能力;Western Blot检测关键蛋白Notch受体胞内段(NICD)、碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白2(BMP2).结果 rDFCs呈成纤维细胞形态;rDFCs中波形丝蛋白明显表达,角蛋白未表达;诱导组ALP染色、茜素红染色均强于对照组;Jagged1第4天后能明显促进rDFCs细胞增殖,DAPT第4天后能显著抑制rDFCs细胞增殖(P<0.05).Jagged1组ALP、BMP2的表达趋势下降,DAPT组ALP、BMP2的表达趋势升高(P<0.05).结论 激活Notch信号通路可促进rDFCs的增殖,抑制Notch信号通路可促进rDFCs的成骨分化.     

Notch信号途径及在牙齿发育中的作用

Notch信号途径是一种进化保守的细胞间作用途径。Notch信号在牙齿发育、牙髓损伤再生中可能与其它细胞因子一起调节细胞的分化、增殖和凋亡。     

低氧环境下Notch信号通路对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响

目的探讨低氧环境下通过低氧诱导因子-1α（HIF-1α）调控Notch信号通路对人牙髓干细胞（HDPSC）成牙本质向分化能力的影响。 方法组织块酶消化法培养HDPSC,给予氯化钴（CoCl₂）诱导的化学性低氧环境,Western blot检测HIF-1α蛋白表达,茜素红染色检测细胞矿化结节形成能力,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Notch下游靶基因Hes1与成牙本质相关基因的表达;进一步加入Notch信号通路特异性阻断剂γ分泌酶抑制剂（GSI）,观察以上指标的变化。报告基因方法检测HIF-1α对Notch信号通路的调控作用。采用R version 3.5.3软件进行统计分析,计量资料进行正态检验,多组间比较采用单因素方差分析（方差齐）或Kruskal-Wallis H检验（方差不齐）,两两比较采用LSD-t检验（方差齐）或Mann-Whitney U检验（方差不齐）。 结果（1）CoCl₂诱导的低氧条件下HDPSC中的HIF-1α蛋白水平上调,Notch下游靶基因Hes1 mRNA相对表达量为1.46 ± 0.12,相比常氧组（1.06 ± 0.09）显著增高（t = -4.64,P = 0.012）;GSI处理阻断Notch信号通路后,低氧条件下HDPSC中HIF-1α蛋白水平下调,Hes1 mRNA相对表达量降低至0.82 ± 0.14,与处理前相比差异有统计学意义（t = 5.98,P = 0.004）;常氧条件下GSI处理后的HDPSC中HIF-1α蛋白水平也明显下调,Hes1 mRNA相对表达量（0.30 ± 0.09）相比处理前也显著降低（t = 10.08,P = 0.001）;（2）矿化诱导后的茜素红染色结果显示：低氧处理后,HDPSC细胞成牙本质分化能力下降;GSI处理后,成牙本质向分化能力增强。成骨/牙本质相关基因mRNA表达水平检测结果显示：低氧处理后,BSP、OCN和DSPP的mRNA相对表达量分别为0.53 ± 0.14、0.43 ± 0.20、0.48 ± 0.11,相比常氧组（1.21 ± 0.12、1.08 ± 0.19、1.03 ± 0.13）显著降低（t_BSP = 6.30,P_BSP = 0.003;t_OCN = 4.07,P_OCN = 0.015;t_DSPP = 5.67,P_DSPP = 0.005）;GSI处理后,低氧条件下BSP、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别为0.99 ± 0.13、1.09 ± 0.13、0.95 ± 0.16,与处理前相比显著增高（t_BSP = -4.17,P_BSP = 0.014;t_OCN = -4.83,P_OCN = 0.012;t_DSPP = -4.30,P_DSPP = 0.017）,常氧条件下BSP、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别为1.73 ± 0.20、1.55 ± 0.08、1.52 ± 0.14,与处理前相比显著增高（t_BSP = -3.84,P_BSP = 0.027;t_OCN = -3.99,P_OCN = 0.035;t_DSPP = -4.43,P_DSPP = 0.011）。（3）荧光素酶报告基因结果显示,HIF-1α可调控NICD启动子,使双荧光素酶相对表达活性为5.37 ± 0.12,与对照组（2.09 ± 0.15）相比显著增强（t = -28.92,P<0.001）,提示HIF-1α可能使Notch信号通路激活。 结论低氧引起HDPSC中HIF-1α升高并可能通过激活Notch信号通路抑制其成牙本质向分化能力。     

EphrinB2 signaling enhances osteogenic/odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells

ObjectiveTo investigate the role of the EphrinB2 signaling pathway in the osteogenesis/odontogenesis of human dental pulp stem cells (DPSCs).DesignThe endogenous expression levels of EphrinB2 and its cognate receptors EphB2 and EphB4 in DPSCs were analyzed by qRT-PCR and Western blotting after 7, 14 and 21 days of osteogenic/odontogenic induction culture. Additionally, the phosphorylation of EphrinB2, EphB4 and ERK1/2 proteins at early time-points following osteogenic induction, were also investigated by Western blots. Subsequently, we investigated whether supplementation of recombinant EphrinB2-Fc within the induction milieu can enhance the osteogenic/odontogenic differentiation of DPSCs.ResultsEndogenous gene and protein expression levels of EphrinB2, EphB2 and EphB4 were upregulated in induced versus non-induced DPSCs, over 21 days of osteogenic/odontogenic induction. Western blots showed increase in phosphorylated EphrinB2, EphB4 and ERK1/2 proteins at early time-points following osteogenic induction. Preliminary investigation of a concentration range (0, 0.5, 1 and 2 μg/ml) of recombinant EphrinB2-Fc within osteogenic induction media, showed that 0.5 μg/ml was optimal for enhancing the osteogenic/odontogenic differentiation of DPSCs over a culture duration of 14 days. Subsequently, more comprehensive qRT-PCR analysis with 0.5 μg/ml EphrinB2-Fc revealed significant upregulation of several key osteogenic marker genes in treated versus untreated DPSCs after 21 days of osteogenic/odontogenic induction. By 7 days of osteogenic induction, DPSCs treated with 0.5 μg/ml EphrinB2-Fc exhibited significantly more calcium mineralization (Alizarin red S staining) and alkaline phosphatase activity than the untreated control.ConclusionsEphrinB2 signaling plays a key role in the osteogenic/odontogenic differentiation of DPSCs.     

经典Wnt信号通路与牙周膜干细胞成骨分化

牙周炎是口腔最常见的疾病之一,累及牙周支持组织,随着疾病的进展将引起附着丧失、牙周袋形成、牙槽骨吸收,最终导致牙齿松动脱落。因被牙周炎破坏吸收的牙槽骨自愈能力十分有限,所以牙周炎的治疗目标是在彻底清除菌斑生物膜的基础上,争取获得较多的牙周组织再生。牙周膜干细胞作为最适宜进行牙周组织再生的细胞,被广泛研究。Wnt信号通路分为经典Wnt通路和非经典Wnt信号通路,为十分复杂而高度保守的通路传导途径。该通路与牙周膜干细胞成骨分化的关系十分密切,牙周膜干细胞的成骨分化又对牙周组织再生有重要意义。该文对经典Wnt信号通路与牙周膜干细胞成骨分化的研究概况作一综述。     

人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较

目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.     

炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响

目的: 观察脂多糖模拟的炎症微环境对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）增殖与成骨分化的影响。方法: 体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、0.1、10 μg/mL脂多糖作用于细胞,采用MTT法观察脂多糖对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western印迹法检测脂多糖模拟的炎症微环境对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 0.1 μg/mL脂多糖促进PDLCs增殖,增强成骨标志物mRNA和蛋白的表达;10 μg/mL脂多糖可抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2的表达,其结果有统计学意义。结论: 高浓度脂多糖（10 μg/mL）模拟的炎症微环境对PDLCs增殖及成骨分化有抑制作用,低浓度脂多糖（0.1 μg/mL）对PDLCs的增殖和成骨分化有促进作用。     

低氧对牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响

目的:观察低氧对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)增殖与成骨分化的影响。方法:体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、100、200、400 μmol/L的CoCl2作用于细胞,采用MTT法观察CoCl2对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western免疫印迹技术检测CoCl2模拟低氧对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化染色结果证实,培养细胞为牙周膜成纤维细胞。200 μmol/L及400 μmol/L的CoCl2均能抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原的表达,并呈剂量依赖性。结论:氯化钴模拟的低氧环境对PDLCs增殖及成骨分化具有抑制作用。     

肿瘤坏死因子-α对牙周膜干细胞骨向分化及Notch信号通路的影响

目的 研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对牙周膜干细胞（PDLSCs）骨向分化及Notch信号通路的影响,初步探讨在TNF-α影响下Notch信号通路对PDLSCs成骨分化的调控作用。方法 采用酶消化结合组织块法获得PDLSCs,通过流式细胞仪检测间充质干细胞（MSCs）表面标记物CD105、CD90、CD146、CD45、CD31的表达,将PDLSCs分为实验组（10 ng·mL^-1 TNF-α）和对照组（不含TNF-α）,使用CCK-8法检测PDLSCs增殖能力;通过碱性磷酸酶（ALP）活性、茜素红染色、实时定量聚合酶链反应（PCR）检测TNF-α对PDLSCs成骨能力的影响;实时定量PCR 检测Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3,配体JAG1、JGA2、DLL1,细胞内效应分子Hes-1的表达。结果 流式细胞仪检测结果显示CD105、CD90及CD146表达阳性,CD45、CD31表达阴性;CCK-8法结果显示TNF-α能够促进PDLSCs增殖能力（P<0.05）;ALP活性检测结果显示,实验组与对照组相比,ALP活性降低（P<0.05）;茜素红染色结果显示,与对照组相比,实验组矿化结节减少;实时定量PCR结果显示,与对照组相比,成骨标志基因牙骨质附着蛋白（CAP）、骨桥蛋白（OPN）、Runt相关转录因子2（Runx2）表达量明显降低（P<0.05）;Notch信号通路相关分子中Notch1、Notch2、JAG1、JGA2、Hes-1的表达水平显著降低（P<0.05）,而Notch3、DLL1的表达水平增高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 TNF-α能够促进PDLSCs增殖而抑制其骨向分化,同时抑制Notch信号通路的表达,说明Notch信号通路对PDLSCs骨向分化具有一定的调控作用。     

改良组织块法体外培养人牙周膜细胞和牙髓细胞

目的:探索一种操作简单方便的人牙周膜细胞和牙髓细胞体外培养方法.方法:取12个正常恒牙牙周膜组织和28个正常恒牙牙髓组织,剪碎组织,将细胞培养专用圆形盖玻片覆盖在组织块上,用凡士林将盖玻片固定在培养皿底壁,然后加入培养液培养,待组织块周围细胞生长密集时,进行原位传代.用免疫细胞化学染色的方法鉴定牙周膜细胞的来源,RT-PCR检测牙髓细胞中牙本质涎磷蛋白基因的表达.结果:在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,可获得牙周膜细胞和牙髓细胞,成功率分别是91.7%和76%.获得的牙周膜细胞和牙髓细胞符合各自的形态学特征和生物学特性,生长良好.结论:本实验建立的改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种培养牙周膜和牙髓细胞的可行方法.     

影响牙周膜干细胞成骨分化能力的因素

牙周膜干细胞(PDLSC)是维持牙周组织动态平衡和缺损修复的关键细胞,被认为是牙周组织工程的关键种子细胞之一.近年来的研究证明其有较强的的增殖和分化能力,然而在不同因素影响下其功能差异也较大.认识并研究这些影响因素不仅有助于深入了解和发掘PDLSC的生物学功能,而且对于今后基于PDLSC的牙周修复与再生治疗具有指导意义.该文就影响PDLSC成骨分化的多种因素作一叙述,展望其在牙周缺损修复治疗中的应用前景.     

Effects of leptin on osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells

目的 探讨瘦素( leptin)对人牙周膜细胞增殖和骨向分化的作用.方法 采用酶消化法体外培养人牙周膜细胞,用不同浓度梯度的leptin处理细胞,通过四唑盐(MTT)比色试验和碱性磷酸酶活性测试,检测leptin对细胞体外增殖分化的影响.将人牙周膜细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙材料作为复合体,植入BALBc免疫缺陷裸鼠,12周后采用组织学和免疫组化法检测裸鼠体内生成物.结果 体外实验leptin对人牙周膜细胞增殖有明显抑制作用,但leptin能促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性表达.体内试验中leptin可提高牙周膜细胞生成类骨质的能力.结论 leptin抑制牙周膜细胞的增殖活性,但可明显促进牙周膜细胞骨向分化.