DNA重组技术在实验动物科学中的应用

DNA重组技术是基因工程的核心，指在体外条件下，将不同生物的基因进行人工。剪切“组合”和“拼接”，使遗传物质重新掏建，然后通过载体如细菌质粒、噬菌体和病毒等转入受体细胞内进行无性繁殖，并使所需要的基因在受体细胞内表达，产生人类所需要的基因或产物，或创建新的生物类型。     

内源性超氧阴离子自由基对食管癌Eca-109细胞癌基因表达的影响

观察内源性超氧阴离子自由基对癌基因表达的影响．方法：构建正、反义人MnSOD（SOD2）真核表达载体，转入食管瘤细胞Eca-109；通过升高或降低细胞内SOD2的水平来增加或减少细胞内O2-的清除从而改变细胞内O2-的水平；以RNA斑点杂交和免疫细胞化学方法检测癌基因表达的变化，以流式细胞仪检测细胞周期变化．结果：基因转入细胞并表达．转染SOD2基因细胞内SOD2水平升高，Cu，Zn-SOD（SOD1）水平未变，细胞内O2-水平下降49％以上；bcl-2表达下调，p53，c-Ha-ras表达轻度上调；流式细胞仪检测S期细胞减少．转染反义SOD2细胞SOD2水平降低，但SOD1活力水平却升高，因而总SOD水平增加，细胞内O2-水平也降低32％以上；bcl-2，p53，ras表达均上调，S期细胞数变化不明显．结论：①通过转SOD2基因改变细胞内O2-水平的方法是可行的，但仍需改进；②细胞内O2-水平的变化可影响癌基因的表达，而且由转染SOD2基因引起细胞内O2-水平降低对Eca-109食管癌细胞的增殖表现出抑制作用．     

基因工程在医学上的应用

基因工程又称转基因工程或重组DNA技术，即在基因水平上对生物进行操作。它是采用类似工程设计的方法，按照人们的需要将具有遗传信息的基因，在离开生物体的情况下进行剪切、组合、拼装，然后把这种人工重组的基因转入宿主细胞内进行大量复制，使遗传信息在新的宿住细胞或个体中高度繁殖，以创造新的生物。     

RNA干扰技术在器官移植免疫中的研究进展

人们早就发现随着细胞内转入基因拷贝数目的增加,其表达水平随之降低,同时内源性同源基因也被转入的基因所抑制。目前已阐明这种抑制的主要机制就是RNA干扰(RNA interference,RNAi),现在认为RNAi是一种原始的细胞免疫机制和基因表达的调控机制,对于维持生物体基     

mBMP-4真核表达载体的构建及表达

0　引言　骨形态发生蛋白 - 4(BMP- 4)具有诱导成骨潜能细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化并形成新骨的能力 .随着基因转染技术的应用 ,将外源基因转入靶细胞内 ,通过靶细胞表达外源基因而发挥作用成为可能 .本研究的目的是通过基因克隆和 DNA重组技术构建可在真核细胞内表达的 BMP- 4表达载体 ,并观测外源基因在细胞内表达的情况 ,为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础 .1　材料和方法1.1　试剂　质粒 pc DNA3和 p SPT- 18- m BMP- 4均由吕振华博士馈赠 ,Eco R I和 H ind III,T4DNA连接酶、…     

含酪氨羟化酶基因的逆转录病毒载体的重组与表达

含酪氨羟化酶基因的逆转录病毒载体的重组与表达首都医科大学北京神经科学研究所郑少鹏田竟生王珂赵春礼鲁强王元身徐群渊由逆转录病毒载体介导的基因转移技术可使外源目的基因被高效地转入宿主细胞内，并在其中高效表达，因此是目前基因治疗研究中应用较多的方法之一。本...     

基因枪

基因枪是将带有基因及mRNA的粒子(约1μm),用超音速直接射入细胞内的装置。与以往的各种基因转移法不同,与种别及组织无关,均可转入,也可转入脑、肌肉等停止分裂的细胞、胚、小器官内。用基因枪,不需进行分解,可以直接将基因转入细胞液及核内。其可广泛用于癌基因治疗、细胞标识以及将基因表达媒介物射入皮下等,使之产生抗体DNA免疫法。     

转基因技术常用的检测方法

将外源基因通过一定载体转入靶细胞内的技术称为转基因技术 (ＧｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｒＧｅｎｅｔｒａｎｓ ｆｏｒｍ )。近十余年来 ,人们广泛利用分子生物学技术对原核细胞和真核细胞进行转基因工作 ,旨在进一步解释人类疾病的发病机制 ,探讨疾病诊断和治疗的新途径。转基因技术一般包括①目的基因获得 ;②将目的基因导入靶细胞内 ;③检测目的基因在靶细胞内表达水平三个重要环节[1] 。因此 ,如何判断外源基因是否导入靶细胞内 ,靶细胞的表达产物是否具有生物效应是转基因技术的重要一环。本文仅就目前常用的有关转基因技术的检测方法…     

成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究

目的：观察损伤对成年动物骨骼肌卫星细胞增殖的影响,以获取基因治疗自体移植的载体。方法：以阳离子脂质体介导法将pRSVLaxZ或pRchTH质粒转入培养肌细胞。结果：骨骼肌损伤后,分离出的肌卫星细胞及组织块游离成肌细胞数均显着增高;外源基因能在细胞内表达。结论：损伤可诱导成年骨骼肌卫星细胞增殖并促进体外培养肌细胞成活。     

串联亲和纯化技术在研究细胞内相互作用蛋白质中的应用

为了进一步研究蛋白质功能并建立蛋白质在细胞内的相互作用网络,各种研究相互作用蛋白质的方法应运而生,串联亲和纯化(TAP)技术就是其中之一。TAP利用基因重组技术将标签基因融合入靶蛋白基因,转入细胞系后表达带标签的靶蛋白,使用标签的特异性对靶蛋白进行纯化和相关研究,而该技术在实际运用会遇到标签选择、标签位置的选择和重组表达等一系列问题,该文介绍TAP技术在实际使用中的技术要点。     

目的基因的转导策略与方法

基因疗法是随着分子生物学进展而出现的一种全新治疗方法。任何基因疗法需采用安全、方便、无毒的措施将目的基因传递至靶细胞或靶器官[1] 。围绕着目的基因的转移和操作 ,国内外学者提出了多种策略。具体方法包含两部分内容。 (1)选择高效转导途径将目的基因转入靶细胞并有效表达 ;(2 )选择合理的治疗策略对机体实施基因治疗。本综述将对这方面的研究作一简要介绍。1　目的基因的转导途径向细胞内转移目的基因的方法可分为两大类 ,病毒载体途径和非病毒载体途径。自从 1990年首次进行基因治疗的临床试验以来 ,已有 5 0 0多项基因疗法获准进…     

逆转录病毒介导IL-2cDNA治疗小鼠淋巴瘤的研究

目的 :研究人白细胞介素 2 (hIL 2 )转基因小鼠淋巴瘤体内成瘤性。方法 :体外将hIL 2基因转入小鼠淋巴瘤p3 88细胞。用PCR、RT PCR、dotblot法检测hIL 2基因在细胞内的整合及表达 ,四甲基偶氮唑盐比色 (MTT)法检测转导细胞hIL 2分泌。体内试验将动物分为A9组、对照组和体内转染治疗组 3组。 17d后处死所有动物 ,观察肿瘤生长状况。结果 :hIL 2基因已成功地整合到小鼠p3 88细胞基因组内。p3 88/IL 2细胞分泌的hIL 2量为 3 7.4U·ml-1。A9组和体内转染治疗组动物肿瘤体积明显减小 ,与对照组肿瘤体积有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 :hIL 2基因经体内或体外法转入p3 88/IL 2细胞后减弱了在小鼠体内的致瘤性     

癌症基因疗法的尝试

近年来,随着分子生物学的飞跃发展,已弄清了许多疾病的病因基因,遗传工程学的进展又是使基因疗法成为可能,即将目标基因转入靶细胞内治疗疾病。1995年日本也开始对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症进行基因治疗,今后希望对癌症、AIDS等顽固性疾病进行基因治疗。但就连基因疗法开展的最盛行的美国,也很难确立比现有治疗方法更出色的方     

人釉原蛋白基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学活性的影响

[目的]分析釉原蛋白基因转染对牙龈成纤维细胞生物学活性的影响,为其进一步应用于基因增强牙周组织工程奠定实验基础.[方法]脂质体转染法将人釉原蛋白基因转入人牙龈成纤维细胞内,Zeoin筛选获得阳性克隆.以ELISA法检测重组釉原蛋白在转染细胞内以及培养上清液中的表达;进一步以MTT比色法分析基因转染对细胞增殖和分化的影响.[结果]釉原蛋白基因转染后,人牙龈成纤维细胞可以在胞内合成重组人釉原蛋白并将其分泌至胞外,表达浓度分别为0.277μg/mL和0.147μg/mL;与未转染组相比,釉原蛋白基因转染可显著促进牙龈成纤维细胞增殖(P＜0.05),并且差异随时间增大.转染后的牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性也较对照组有显著提高(P＜0.05).[结论]外源性釉原蛋白基因能够在人牙龈成纤维细胞获得表达,并显著促进其增殖以及向成骨细胞方向转化,可以应用于基因增强牙周组织工程.     

泌尿系肿瘤基因治疗进展

随着分子生物学的发展以及人们在基因水平上对肿瘤发生、发展及生物学行为的深入,不但可在分子水平上作出肿瘤生物学行为的诊断,以指导选择正确的治疗原则,而且近年更是发展了在基因水平上的治疗方法。１９８５年Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ证明了逆转录病毒载体（ＲＶ）在人体进行基因治疗的安全性,并于１９９１年获准用ＲＶ把ＴＮＦ基因转入肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）进行肿瘤的基因治疗,从而揭开了肿瘤基因治疗的序幕。近年来国内外在肿瘤基因治疗领域进行了大量研究,并取得了可喜成果。１　基因转染载体选用合适载体把目的基因转入细胞内…     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

乙型肝炎DNA疫苗研究进展

DNA疫苗也有基因疫苗、核酸疫苗、DNA免疫、基因免疫等各种名称和相关概念.有人将DNA疫苗称为第三代疫苗.第一代疫苗以Jenner用牛痘预防天花为代表,人类从此开始摆脱许多疾病的困扰.第二代疫苗是运用基因重组技术,以特定的基因表达产生的抗原作为疫苗,重组乙型肝炎疫苗就是典型例子.DNA疫苗则是将编码目的抗原的基因与载体重组以后,经不同途径将基因直接转入机体细胞内,利用宿主细胞内的表达加工机构合成抗原,从而激发体液免疫和细胞免疫.近年来,DNA疫苗在打破HBV慢性感染的免疫耐受方面取得了一定的进展,对乙型肝炎及HBV无症状携带状态的临床治疗提供了值得探索的新途径.     

pSG5-Cbfa1转染兔皮肤成纤维细胞及其瞬时表达

目的　探讨外源性小鼠Cbfa1基因在兔皮肤成纤维细胞中获得瞬时表达的可行性。方法　在阳离子脂质体介导下 ,将含外源性小鼠Cbfa1基因的 pSG5 Cbfa1真核表达质粒导入原代培养的第 2代兔皮肤成纤维细胞内。采用RT PCR及Western Blot法检测Cbfa1基因在兔皮肤成纤维细胞内的瞬时表达。同时采用RT PCR法检测细胞内骨钙素及碱性磷酸酶基因的表达情况。结果　转染pSG5 Cbfa1真核表达质粒的兔皮肤成纤维细胞内有大量小鼠Cbfa1mRNA转录及蛋白瞬时表达 ,同时诱导骨钙素mRNA及碱性磷酸酶mRNA大量表达。结论　在阳离子脂质体介导下 ,小鼠Cbfa1基因能够导入兔皮肤成纤维细胞内并获得瞬时表达 ,同时诱导细胞内成骨特异性骨钙素基因及碱性磷酸酶基因的转录     

嗜肺军团菌mip基因真核表达重组质粒构建与表达

目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1( )转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。     

遗传工程简介

<正> 遗传工程或基因工程,是在无细胞系统中,将不同的DNA片段(cDNA或基因DNA与载体DNA)连接成重组的DNA分子,然后将重组分子转入合适的宿主中,成为宿主基因组的一个整体份系或独立地在宿主细胞内进行复制。由此可知,遗传工程的核心是分子的无性繁殖。在自然界,遗传信息的交换一般只限于同种生物体之间。遗传工程技术的出现打破了遗传信息交换的壁障,能使不同种生物体之间甚至在高等生物与低等生物之间进行遗传信息的传递,因而可以按照人类的希望,在短期内定向地改变生物特性并创造新物种,以造福人类。基因工程是否可造成严重危害的争论曾