基因工程抗体anti-HBsAg Fab原核表达体系大规模培养条件的实验研究

目的 探讨含anti-HBsAg Fab／pBAD表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养条件。方法 在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律．摸索最佳的培养模式及诱导表达条件。后根据摇瓶发酵结果于发酵罐中行补料高密度发酵试验，确定最佳补料模式。结果 由摇瓶发酵获得的数据表明，以培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点、在25℃条件下以0．2％阿拉伯糖诱导12h，Fab的得率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大D600达到55．2，相当于湿菌含量110g／L水平；同时，经证实Fab的抗原结合活性良好。结论 初步确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺路线．为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

真核细胞表达基因工程抗体的研究进展

大肠杆菌E.coli表达系统是非常常用、有效和方便的表达系统,可以进行许多异源蛋白的高效表达。然而原核细胞系统表达蛋白时,存在多种缺陷:真核基因通常含有内含子,原核细胞不能对其进行正确的剪切和拼接;缺乏真核生物的蛋白翻译后修饰和加工;表达产物多以包涵体形式存在,复性困难且效率     

基因工程抗体anti-HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究

目的 探讨含anti-HBsAg Fab/pBAD表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养条件。方法 在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,摸索最佳的培养模式及诱导表达条件。后根据摇瓶发酵结果于发酵罐中行补料高密度发酵试验,确定最佳补料模式。结果 由摇瓶发酵获得的数据表明,以培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点、在25 ℃条件下以0.2% 阿拉伯糖诱导12 h,Fab的得率最佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大D₆₀₀达到55.2,相当于湿菌含量110 g/L水平;同时,经证实Fab的抗原结合活性良好。结论 初步确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺路线,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

甲型副伤寒杆菌ompX基因原核表达及表达产物免疫原性鉴定

目的构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因ompX的原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpX免疫原性。方法采用PCR从甲型副伤寒杆菌标准株50001扩增目的基因并构建其原核表达系统,IPTG诱导表达目的蛋白,提取并纯化表达产物。采用免疫扩散法和Western blot鉴定其免疫原性。结果成功构建了ompX的原核表达系统,rOmpX表达量约为细菌总蛋白的28%。rOmpX免疫家兔可产生抗体并能与重组蛋白rOmpX产生阳性Western blot杂交信号。结论成功构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因ompX的原核表达系统,rOmpX具有良好的免疫原性,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原之一。     

人乙醇脱氢酶原核表达载体构建及产物活性测定

目的:构建人乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)原核表达载体,在表达菌BL21中进行体外原核表达并测定ADH蛋白的酶学性质。方法:用RT-PCR技术从人肝RNA中克隆ADH开放阅读框架序列,并与表达载体pET-5a连接、转化入宿主菌BL21中,并经培养、筛选、酶切和测序鉴定。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达菌并测定表达蛋白的酶学参数。结果:原核表达载体pET-5a-ADH构建成功;表达蛋白分子量在40 kD左右;酶学测定表明表达蛋白是一种耐酸、耐高温的脱氢酶,钾离子和三价铁离子对其酶活性有促进作用,二价金属离子对其活性有抑制作用。结论:人ADH原核表达载体pET-5a-ADH成功构建,原核表达产物具有一定的ADH蛋白活性。该研究为进一步了解ADH酶学性质,探讨酶活性多态性与疾病的关系打下基础。     

人TRAIL胞外区原核可溶性表达及活性鉴定

目的获得具有生物活性的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)胞外段蛋白。方法根据大肠杆菌密码子偏爱性要求,设计合成编码TRAIL胞外段的DNA序列,构建成pET30a-TRAIL胞内融合表达质粒,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21。在不同温度、不同浓度的IPTG条件下诱导表达TRAIL,SDS-PAGE分析表达产物,MTT法检测产物活性。结果构建的工程菌株表达29KD的可溶性TRAIL融合蛋白,能诱导Jurkat细胞凋亡。结论成功表达了人TRAIL胞外段蛋白,为进一步研究提供基础。     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的 克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析.方法 提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上.对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b(+)载体后转化Origmai B(DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析.结果 对所克隆的Klf4 mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4 CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b(+)-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳.结论 从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达.     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

人颗粒溶素的原核表达

目的克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达。方法体外培养外周血单个核细胞并抽提总RNA,RT．PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,鉴定正确后构建原核表达质粒pET—GNLY9K和pET—GNLYl5K,并将其转入大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS—PAGE和Western—blotting鉴定融合蛋白的正确性。结果成功构建了原核表达载体pET—GNLY9K和pET—GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量分别约为31和37kD的融合蛋白。结论利用原核表达体系成功表达了不同相对分子质量的颗粒溶素融合蛋白。     

干扰素诱导蛋白IFIT1的克隆与原核可溶性表达

目的研究干扰素诱导蛋白IFIT1的原核可溶性表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得IFIT1编码序列,克隆入原核表达载体,电穿孔转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,诱导细菌表达,蛋白凝胶电泳观察。结果构建的原核表达平台实现了较丰富的麦芽糖结合蛋白融合IFIT1(MBP-IFIT1)可溶性表达。结论 MBP-IFIT1的原核可溶性表达为后续IFIT1蛋白结合分析及免疫分析提供了材料及方法学基础。     

ING4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白，制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a（＋）-ING4，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a（＋）-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白10％以上，以包涵体形式存在，纯化后其纯度可达70％以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

人氨肽酶N基因克隆和原核表达

目的：构建人氨肽酶N(APN)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(APN-GST)，并进行原核表达。方法：根据人APN mRNA序列设计合成特异性引物，从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链，RT-PCR扩增人APN基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T，转化宿主菌BL21(DE3)细胞，异丙基锍基半乳糖(IPTG)诱导表达APN蛋白。包涵体经尿素变性、重折叠和亲和层析纯化。结果：重组质粒测序和酶切结果显示：APN基因已正确插入pGEX-4T，重组蛋白及纯化产物SDS-PAGE在135000处有一条明显的蛋白表达条带。结论：人APN基因已被成功地克隆、表达和纯化。     

小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法从BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法获得CD25分子胞外段序列;将其亚克隆入原核表达载体PET-32a,构建好PET-32a-CD25胞外段,并进行酶切及测序鉴定;将PET-32a-CD25胞外段转染大肠杆菌BL21进行表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。结果RT-PCR扩增出708 bp的CD25胞外段的基因片段;pET32a-CD25胞外段/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为47×103,重组蛋白用镍树脂纯化后经Western blot检测显示具有良好的免疫反应性,并且可以在体外有效刺激自体T细胞疫苗免疫小鼠脾细胞的增殖并高分泌IL-4。结论CD25胞外段蛋白在原核细胞中成功表达,纯化后的蛋白保持良好的免疫反应性。     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

大鼠血红素氧化酶 1的基因克隆和原核表达

目的：从大鼠脾中克隆出血红素氧化酶1（RHO-1）基因，构建其原核表达载体，并在大肠杆菌中表达其蛋白。方法：用RT-PCR从大鼠脾总RNA中扩增出RHO-1 cDNA，并将其克隆入pMD18-T载体， 经TA克隆测序分析后,将阳性TA克隆RHO-1片段亚克隆入pET28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌BL-21，经限制性内切酶图谱鉴定后，阳性菌株经IPTG诱导，SDS-PAGE分析。结果：TA克隆测序分析证实该基因全长870 bp,编码289个氨基酸,所克隆的基因序列与GenBank中登录的RHO-1基因序列完全一致；限制性内切酶图谱结果表明成功构建了RHO-1的原核表达载体；SDS-PAGE结果显示RHO-1基因在大肠杆菌中获得表达。结论：用RT-PCR正确克隆RHO-1基因，构建pET28a(+)/RHO-1表达载体，并成功表达RHO-1融合蛋白。     

重组血红蛋白的原核表达、纯化和鉴定

目的利用大肠杆菌表达载体,表达血红蛋白(Hb)基因,并进行纯化及鉴定。方法将原核表达载体pHE 2-Hb转化入E.Coli JM109,经IPTG诱导表达;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,用Western blot鉴定纯化出的目的蛋白。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量约为67 kD,与理论值相一致;应用阴离子交换层析、阳离子交换层析分级纯化目的蛋白,Western blot检测表明得到纯度较高的目的蛋白。结论利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究Hb的生物传氧机制研究和以Hb为基础载氧药物的研究提供重要基础和研究依据,并将为血液替代品和相关疾病的治疗研究奠定研究基础。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的原核表达及鉴定

【目的】构建丙型肝炎病毒（HCV）包膜蛋白E2基因的重组原核表达质粒，并获得E2蛋白的高效表达。【方法】通过RT-PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCVE2区基因595bp，PCR产物分别经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体PET22b（＋）上，转化大肠杆菌DH5α菌株，获得阳性重组质粒PETB，阳性质粒转化BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Westemblot鉴定。【结果】成功地克隆了HCVE2区基因，构建了其原核表达质粒，并在BL21（DE3）菌中表达HCVE2重组蛋白，Western blot显示表达蛋白具有抗原性。【结论】HCVE2重组蛋白的表达和鉴定为进一步了解HCV糖蛋白E2的功能及其与CD81二者的相互关系打下基础。     

内源性血管生成抑制因子Arresten原核表达载体的构建及表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并在E.coliDH5α进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coliDH5α进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因并构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。