体外诱导脐血造血细胞定向分化的研究

目的　探讨造血生长因子体外诱导脐血造血细胞向粒系细胞分化的能力。方法　从新鲜的脐血标本中分离的单个核细胞接种于含脐血血清和造血生长因子的IMDM培养液中悬浮培养 5周 ,采用有核细胞计数、免疫荧光染色计数和祖细胞集落测定对有核细胞总数、CD3 4+ 细胞和粒单系祖细胞进行动态检测。结果　用粒系集落刺激因子、粒单系集落刺激因子、干细胞因子、白介素 3和白介素 6培养脐血单个核细胞 3周 ,可以显著扩增有核细胞总数和CFU GM ,扩增倍数分别为培养前的 5 8 3倍和 12 2倍 ,且培养后的细胞以中性粒细胞为主。而CD3 4+ 细胞占细胞总数的比例则从 0 97%下降到 0 0 5 %。按照此培养条件 ,可以使单份新鲜脐血样本中有核细胞总数增加 ( 5 1± 2 3 )倍 ,CFU GM增加 ( 2 2± 0 95 )倍。结论　本培养体系在体外可以诱导脐血造血细胞向粒系定向诱导分化 ,从而增加单份脐血中粒单系祖细胞和粒细胞数量     

细胞因子组合对小鼠骨髓单核细胞的体外扩增作用

目的　了解细胞因子组合对小鼠骨髓单个核细胞的体外扩增作用。方法　采用SCF、IL 3、IL 6、GM CSF、G CSF和EPO等 6种细胞因子组合在体外扩增培养小鼠骨髓单个核细胞 5d后 ,收集培养细胞作体外半固体培养计数各不同阶段祖细胞数 ,并计数细胞总数 ,与未经扩增培养的细胞作比较以判断其扩增情况。结果　有核细胞总数扩增不显著 ,为 (1 .3 60± 0 .1 2 6)倍 ,但造血祖细胞却获得了明显扩增 ,其中CFU E达培养扩增前的 (7.0 4± 1 .2 6)倍 ,BFU E为 (4 .74± 1 .0 4)倍 ,CFU GM和CFU Cs则分别为 (1 .78± 0 .47)和 (1 .74± 0 .48)倍。由此可见 ,在此培养体系中以红系祖细胞的扩增最为显著。结论　小鼠骨髓单个核细胞在单纯细胞因子存在的扩增体系中具有一定的扩增其细胞总数和集落形成祖细胞数的能力 ,为进一步作体内实验判断其造血重建的功能奠定了理论基础。     

脐血CD34~+细胞体外短期培养扩增研究

为寻找更有效的体外扩增脐血CD34 + 细胞的造血细胞因子组合 ,采集健康产妇脐带血 ,用免疫磁珠法分选CD34 + 细胞。采用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34 + 细胞短期无血清液体培养 ,观察培养前后有核细胞、CD34 + 细胞、CD34 + /CD38- 细胞、CFU GEMM、CFU GM和BFU E数量的变化。结果在 3种不同的细胞因子组合中 ,同时应用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子培养 7d的扩增效果最好。突出的发现是在这种条件下CD34 + /CD38- 细胞亚群达到平均 1 97.9倍的扩增效果。提示 :SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子是脐血CD34 + 细胞体外扩增理想的细胞因子组合     

全反式维甲酸对正常人脐血及正常小鼠造血细胞作用的研究

目的 了解全反式维甲酸（ATRA）在体外对正常人脐血造血细胞的作用以及其在体内对正常小鼠造血细胞的作用。方法 （1）在人脐血单个核细胞（MNC）的粒系集落形成单位（CFU－GM），红系集落形成单位（BFU－E）和混合集落形成单位（CFU－GEMM）的半固体培养基中加入不同浓度的维甲酸，观察其对人脐血造血细胞集落形成的影响；（2）用含0.5μmol/L ATRA和IL－6，G－CSF，EPO，SCF的体系培养人脐血MNC，第7，14天时检测扩增后的人脐血有核细胞（NC）数，CD34^ 细胞数并观测其CFU－GM，BFU－E和CFU－GEMM形成；（3）用不同剂量的ATRA处理BABL／c小鼠，分别于处理后2，4，6，8，10d检测小鼠外周血中CD34^ 细胞，WBC，RBC及PLT含量的变化，从而观察ATRA在体内对造血2细胞的影响。结果 （1）一定浓度的ATRA在体外能明显促进人脐血CFU－GM的生长，但对BFU－E，CFU－GEMM的形成无影响；高浓度时抑制CFU－GM，BFU－E和CFU－GEMM的形成。促进CFU－GM形成的最佳ATRA浓度为0．5μmol/L，浓度为5．0μmol/L时开始起抑制作用；当浓度达到10μmol/L时，无任何集落形成。（2）0．5μmol/LATRA联合IL－6，SCF，G－CSF和EPO须体外孵育人脐血MNC，第7天和第14天时，ATRA组NC数与对照组相比无显性差异；但其CD34^ 细胞数明显高于对照组，差异有显性（P＜0．05）；且ATRA组CFU－GM， CFU－GEMM及BFU－E的形成数均明显高于对照组（P＜0．05）；（3）不同剂量的ATRA处理小鼠8d后，其WBC及CD34^ 细胞均开始升高，与对照组相比，差异有显性（P＜0．05）；但不同剂量的ATRA对小鼠的RBC及PLT均无明显影响。结论 （1）浓度为0．1－0．5μmol/L的ATRA在体外能促进人脐血造血细胞CFU－GM的生长，但对BFU－E及CFU－GEMM的形成无影响；当浓度达到5μmol/L时，ATRA对各系集落的形成均起抑制作用，且随浓度的增加抑制作用增强。（2）液体培养时，ATRA联合造血细胞刺激因子能延迟人脐血CD34^ 细胞的分化。（3）在正常小鼠体内ATRA能促进小鼠WBC及CD34^ 细胞的增殖，但对小鼠RBC及PLT无影响。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用

目的 :探讨胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用。方法 :联合应用胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子如重组人干细胞因子 (rh SCF)、IL - 3、IL - 6、粒巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF)、粒细胞集落刺激因子 (G- CSF)、促红细胞生成素 (EPO)等先后对成人骨髓单个核细胞及 CD34 + 富集细胞培养 5 d至 2周。结果 :胎儿骨髓基质细胞与上述细胞因子具有良好的协同作用 ,CD34 +富集细胞以胎儿骨髓基质细胞 +SCF+IL- 3+IL- 6 +G- CSF+EPO培养 2周 ,可使细胞总数、粒 -单系造血祖细胞 (CFU- GM)、早期红系造血祖细胞 (BFU- E)及 CD34 +细胞分别扩增 (119.6± 30 .9)倍、(5 4.6± 17.4)倍、(2 5 .2± 4.4)倍、(11.1± 4.2 )倍。结论 :胎儿骨髓基质细胞可协同上述外源性细胞因子支持成人骨髓造血祖细胞的有效扩增     

IL-11基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响

目的　研究造血因子白介素 11(IL 11)基因修饰的基质细胞对造血细胞体外扩增的影响。方法　采用逆转录病毒载体将IL 11基因转入基质细胞HFCL ,用Northernblot检测基质细胞HFCLIL 11基因的表达 ,用流式细胞仪检测IL 11基因修饰的HFCL支持的脐血CD3 4 + 造血细胞体外扩增中表型为CD3 4 + CD3 8- 早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系定向祖细胞的比例。结果　基质细胞HFCL能够表达逆转录病毒介导的IL 11基因 ,并且在这种IL 11基因修饰的基质细胞支持下 ,脐血CD3 4 + 造血细胞经过7d扩增 ,扩增细胞中表型为CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和表型为CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞的比例分别为 (1.62± 0 .2 3 ) %、(9.9±1.1) % ,高于未转基因HFCL的 (0 .8± 0 .2 3 ) %、(6.5± 1.8) % ,而在相同条件下细胞因子支持的扩增细胞中则分别为 (0 .19±0 .14 ) %、(6.0± 1.1) %。结论　基质细胞能够表达经逆转录病毒载体介导的IL 11基因 ,而且经IL 11基因修饰的基质细胞能显著促进CD3 4 + CD3 8- 的早期祖细胞和CD3 4 + CD41+ 巨核系祖细胞扩增。     

中晚孕期与足月胎儿脐血干/祖细胞功能特性研究

目的　对比研究中、晚孕期和足月胎儿脐血造血干 /祖细胞的表型及功能特性 ,为造血干细胞宫内移植和基因治疗先天性疾病提供新的思路。方法　采用免疫磁珠分离法、流式细胞术、液体培养、半固体甲基纤维素培养等对中、晚妊期及足月胎儿脐血造血干 /祖细胞比例、对细胞因子的反应性、体外增殖及自我更新能力进行了测定。结果　未足月脐血中CD34+ 、CD34+ CD38- 细胞及CD34+ 细胞中CD34+ HLL DR+ 、CD34+ CD38- 细胞比例较足月脐血高 (平均 3 1 4 %、0 76 %比 0 78%、0 1 8%及 9 8%、2 0 4%比 3 9%、1 4 6 % ) ,产生的集落形成单位量 (CFU)较足月脐血高 ,且与CD34+ 细胞比例成正相关 (r =0 83) ,长期培养启动细胞 (LTC IC)约是足月脐血的 3倍 (5 7± 1 2 / 1 0 5细胞比1 7± 0 8/ 1 0 5细胞 ,P <0 0 5)。在短期液体培养体系中 ,不同胎龄脐血干 /祖细胞具有相似的扩增潜能 ,体外细胞因子支持下培养 7天 ,CFU C、细胞总数、CD34+ 细胞数、CD34+ CD38- 细胞数达高峰 ,之后逐渐下降 ,其中以SCF +FL +TPO +IL 3 +IL 6组合条件下效果最显著。结论　未足月胎儿 (尤其是中妊期 )脐血与足月胎儿脐血相比 ,含有较高的造血干 /祖细胞 ,有较强的集落形成能力 ,对细胞生长因子刺激敏感 ,在体外能有效地扩增和     

脐血造血干／祖细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应。方法 采用Mini-MACS分离纯化出CD34^ 细胞,在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况。结果 培养4周后,FL＋TPO＋SCF＋IL－6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加（P＜0．05）,并且能维持一定比例的CD34^ 、Thy-1^ 细胞;SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34^ 细胞基本检测不到。结论 与经典因子组合SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO相比,因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6能在较长时间内有效扩增脐血造血干／祖细胞,是一个优化组合方案。     

CD34+细胞体外定向诱导分化的实验研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对CD34+细胞体外定向诱导分化作用.方法:应用阴性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC),在液体培养体系加入不同组合细胞因子对CD34+细胞进行诱导,检测细胞总数、CD71+细胞和CD15+细胞比例及粒单系祖细胞和红系祖细胞扩增数量.结果:液体培养体系中,以FL+Tpo+SCF+IL-3+Epo细胞因子组合对CD34+细胞向红系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD71+细胞比例为61.20%±5.31%,BFU-E、CFU-E分别扩增27.12±3.95和30.65±40.26倍.以FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF细胞因子组合对CD34+细胞向粒系细胞的诱导分化能力最强,2w后CD15+细胞比例为56.18%±6.57%,CFU-GM扩增29.87±10.52倍.结论:合理组合生长因子,可定向诱导CD34+细胞生成大量血细胞,将有助于满足临床应用的需要.     

造血微环境对造血机能影响的研究进展

造血干细胞（hemopoietic stem cells,HSCs）的造血活性主要由造血微环境＂龛＂所决定,因此掌握造血微环境对造血机能的影响是理解造血功能修复的良好途径。本文就造血微环境对造血机能影响的研究进展进行综述。     

重视造血干细胞移植中的造血微环境问题

造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是治疗血液肿瘤、非恶性血液病、遗传性疾病、代谢性疾病、急性放射病的有效手段之一,已在临床应用35年.造血干细胞移植的成败主要取决于供者造血干细胞能否在宿主的造血微环境中正常地增殖和分化,且尽量避免和降低移植并发症所带来的风险.既往对造血干细胞配型、移植物抗宿主病、移植失败和移植后疾病复发等问题的研究多侧重在造血干细胞方面,而对造血干细胞赖以生存的微环境缺乏足够的重视和研究[1-2].本研究主要阐述造血微环境功能在造血干细胞移植过程中的主要变化和作用,以期引起对该问题足够的重视和关注.     

造血因子对再生障碍性贫血造血重建的作用

再生障碍性贫血(简称再障)是以骨髓造血功能障碍引起骨髓有核细胞增生低下,外周血全血细胞减少为特征的一综合症.     

体外扩增造血细胞重建小鼠造血功能的实验研究

目的 探讨体外扩增造血祖儿定向诱导功能血红细胞生成的条件及扩增细胞重建长期造血能力的维持。方法 应用免疫磁珠法（ＭＡＣＳ）分离纯化脐带血ＣＤ３４＾＋造血干或祖细胞,在体外液体培养体系中经不同细胞因子的组合进行扩增和定向诱导,并将扩增细胞移植经亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果 ＦＬ、干细胞因子血小板生成素（ＴＰＯ）等细胞因子的不同组合可分别扩增细胞总数、粒系及巨核系造血祖细胞、ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８     

造血干细胞联合骨髓间充质干细胞移植实验效果观察

目的:对骨髓间充质干细胞(MSC)在造血干细胞移植后造血重建中的作用进行探讨.方法:分离培养水囊引产4～5个月龄胎儿来源的骨髓MSC和脐血CD34 造血干/祖细胞(HSC),作为供体细胞.23只重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠作为受体,随机分成4组,137Cs全身照射350 cGy后,在4 h内从尾静脉输入供体细胞.①阴性对照组:5只,不输入任何细胞.②阳性对照组:6只,单纯输入HSC 5×106ml-1.③实验Ⅰ组:6只,输入HSC5×106ml-1和MSC 5×106ml-1.④实验Ⅱ组:6只,输入HSC 5×106ml-1和MSC 5×108ml-1.输注后观察各组小鼠的存活情况;每周计数外周血单个核细胞(MNC)总数;移植后第7周,PCR检测外周血人体细胞DNA,并用流式细胞仪测定供体骨髓人源细胞嵌合比例.结果:阴性和阳性对照组小鼠均于10 d内死亡,骨髓病理切片提示小鼠死于骨髓衰竭.实验Ⅰ、Ⅱ组小鼠均保持良好的生存状态,皮肤黏膜无溃烂、出血,毛发无缺损.实验Ⅰ、Ⅱ组外周血象逐渐回升,第3周,实验Ⅱ组外周血MNC数量(2.63±0.32)×109 L-1,高于实验Ⅰ组的(1.33±0.21)×109L-1(P＜0.01),第5周即恢复正常水平.第7周,实验Ⅰ、Ⅱ组小鼠外周血均检测出供体细胞;实验Ⅱ组人源细胞嵌合比例为(7.41±0.79)%,高于实验Ⅰ组(5.11±0.07)%(P＜0.05).结论:SCID小鼠致死剂量照射后,联合输入HSC和MSC可明显促进造血干细胞移植后造血重建,且不增加移植物抗宿主病的发生率.     

异基因造血干细胞移植的几个重要问题

近年来 ,干细胞成为生物医学领域研究的热点 ,数次被 Science杂志列入世界十大科技进展。造血干细胞作为研究最早、最为深入的成体干细胞 ,其临床应用已有 40余年的历史 ,美国的 Thomas教授因为在造血干细胞移植 (hematopoietic stem cell trans-plantation,HSCT)理论和技术方面的开拓性贡献 ,于 1 990年获得诺贝尔医学奖。 2 0世纪 90年代以来 ,HSCT技术飞速进展 ,更为安全有效 ,病例数迅速增加 ,已成为当今治愈多种良、恶性血液病与遗传性疾病的重要手段 ,受益病种还在不断扩大 ,比如某些实体肿瘤和重症自身免疫性疾病等[1] 。本文试…     

脐血浆造血活性的研究

目的　研究脐血浆刺激造血细胞体外生长的作用及脐血浆造血因子的水平。方法　以ELISA法检测 33例脐血浆GM -CSF ,IL - 3和IL - 6水平 ,RIA法检测EPO水平 ,液体培养和甲基纤维素半固体培养方法检测脐血浆对外周造血干细胞 (PBSC)造血刺激活性 ,并分析二者的相关性。结果　①脐血浆造血因子中位数和全距水平分别为 :GM-CSF为 0ng/L和 0～44ng/L ,IL - 3为 3ng/L和 0～ 35ng/L,IL - 6为 3ng/L和 0～ 2 1ng/L ,EPO为 1 6U/L和 5～ 72U/L ;②脐血浆刺激下PBSC半固体培养造血祖细胞集落数为 (1 3± 1 1 ) / 1× 1 0 5细胞 ,胎牛血清刺激下的集落数为 0 ,二者差异有显著性 (P <0 .0 1 )。脐血浆或胎牛血清刺激下PBSC液体培养有核细胞数分别为 (1 .0 8± 0 .2 0 )× 1 0 6 /ml与 (0 .72±0 .0 5)×1 0 6 /ml,二者差异有显著性 (P <0 .0 5) ;③脐血浆刺激下PBSC体外培养集落数和有核细胞数均与脐血浆IL -3水平成正相关 ,相关系数分别为 0 .660和 0 .397,与IL - 6和EPO则不相关。结论　脐血浆含有多种造血因子 ,在体外具有刺激造血细胞生长的作用。脐血浆刺激造血活性与其所含有的造血因子有关 ,造血活性的高低与IL - 3浓度成正相关。IL - 6和EPO所起的作用则相对较小。     

The biology of hematopoietic stem cells

Rarely has so much interest from the lay public, government, biotechnology industry, and special interest groups been focused on the biology and clinical applications of a single type of human cell as is today on stem cells, the founder cells that sustain many, if not all, tissues and organs in the body. Granting organizations have increasingly targeted stem cells as high priority for funding, and it appears clear that the evolving field of tissue engineering and regenerative medicine will require as its underpinning a thorough understanding of the molecular regulation of stem cell proliferation, differentiation, self-renewal, and aging. Despite evidence suggesting that embryonic stem (ES) cells might represent a more potent regenerative reservoir than stem cells collected from adult tissues, ethical considerations have redirected attention upon primitive cells residing in the bone marrow, blood, brain, liver, muscle, and skin, from where they can be harvested with relative sociological impunity. Among these, it is arguably the stem and progenitor cells of the mammalian hematopoietic system that we know most about today, and their intense study in rodents and humans over the past 50 years has culminated in the identification of phenotypic and molecular genetic markers of lineage commitment and the development of functional assays that facilitate their quantitation and prospective isolation. This review focuses exclusively on the biology of hematopoietic stem cells (HSCs) and their immediate progeny. Nevertheless, many of the concepts established from their study can be considered fundamental tenets of an evolving stem cell paradigm applicable to many regenerating cellular systems.     

当归多糖动员的造血干/祖细胞移植重建小鼠造血功能的研究

目的 探讨当归多糖（Angelica polysaccharides,APS）动员的造血干／祖细胞（hematopoietic stem／progenitor cell．HSPC）对造血衰竭小鼠造血功能重建的作用。方法 将APS动员的雄性BALB／c小鼠的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）静脉输注给受到8．5Gy^60Coγ射线照射的雌性同系受体小鼠;观察受体小鼠外周血白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）的变化及30d存活情况;采用PCR方法鉴定其造血重建的来源。结果 APS组受体小鼠WBC、PLT、HGB、30d存活数均明显高于对照组和NS组（P〈0．05）;对APS组存活小鼠进行Y染色体PCR分析,证实雌性受体小鼠重建的造血细胞来自雄性供体。结论 APS动员的小鼠外周血HSPC移植后能够重建造血衰竭小鼠长期造血。     

Identification and isolation of hematopoietic stem cells

Hematopoietic stem cells (HSCs) are defined by their ability to repopulate all of the hematopoietic lineages in vivo and sustain the production of these cells for the life span of the individual. In the absence of reliable direct markers for HSCs, their identification and enumeration depends on functional long-term, multilineage, in vivo repopulation assays. The extremely low frequency of HSCs in any tissue and the absence of a specific HSC phenotype have made their purification and characterization a highly challenging goal. HSCs and primitive hematopoietic cells can be distinguished from mature blood cells by their lack of lineage-specific markers and presence of certain other cell-surface antigens, such as CD133 (for human cells) and c-kit and Sca-1 (for murine cells). Functional analyses of purified subpopulations of primitive hematopoietic cells have led to the development of several procedures for isolating cell populations that are highly enriched in cells with in vivo stem cell activity. Simplified methods for obtaining these cells at high yield have been important to the practical exploitation of such advances. This article reviews recent progress in identifying human and mouse HSCs and current techniques for their purification.