siRNA表达载体对肝素酶基因的沉默作用

目的根据基因库中的人肝素酶(HPSE)基因序列,构建针对肝素酶基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染MDA-MB-231细胞后观察其对肝素酶基因的干扰作用。方法设计肝素酶靶向的发夹状siRNA,合成2条互补的寡核苷酸链共4对,退火后连接入pGPU6/GFP/Neo载体,转化后进行序列鉴定,转染MDA-MB-231细胞,荧光照片,RT-PCR(real-time PCR)检测肝素酶mRNA的表达情况。结果设计出4条针对肝素酶的siRNA,将退火后的双链寡核苷酸片段克隆到pGPU6/GFP/Neo载体,经过阳性菌落酶切鉴定与测序,结果正确。再将siRNA载体转染到MDA-MB-231细胞株,RT-PCR检测肝素酶mRNA表达明显降低(P0.05)。结论成功构建了针对肝素酶基因的siRNA载体,转染到MDA-MB-231细胞株后细胞肝素酶基因的表达明显降低,从而为肿瘤治疗提供了一种新的方法。     

siRNA表达载体对乙酰肝素酶基因有效序列的筛选

目的：根据基因库中的人乙酰肝素酶（HPSE）基因序列,构建针对乙酰肝素酶基因的小干扰RNA（siRNA）及其表达载体,转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法：设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链（共4对）,退火后连接入pG-PU6/GFP/Neo载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染MDA-MB-231细胞株,免疫蛋白印迹（West-ernblot）检测细胞蛋白质的表达。结果：设计出4条针对HPSE的siRNA,将退火后的双链寡核苷酸片段克隆到pGPU6/GFP/Neo载体,经过阳性菌落酶切鉴定与测序,结果正确,并通过脂质体转染方法转染到MDA-MB-231细胞株,Westernblot检测细胞蛋白质的表达明显降低。结论：成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染MDA-MB-231细胞后,HPSE蛋白的表达降低,其中HPSE-A和HPSE-B可明显抑制HPSE的表达。     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

小RNA干扰VEGF-C基因表达对乳腺癌细胞增殖及凋亡的体外研究

目的:利用质粒pSilencer3.0-H1构建人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因经小RNA干扰(siRNA)的表达载体,体外研究其对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖及凋亡作用,为乳腺癌VEGF-C基因靶向RNA干扰治疗的可行性作初步探讨.方法:构建3组针对VEGF-C的pSilencer3.0.VEGF-C/siRNA表达载体和1组阴性对照序列.测序鉴定后.将脂质体介导转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435.用RT-PCR和Western Blot检测转染前后VEGF-C基因的表达.挑选干扰效率最强的一组表达载体.以MTT法和流式细胞仪检测经siRNA干扰的VEGF-C对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的体外作用.结果:经测序鉴定,VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功,转染人乳腺癌细胞MDA-MB-435后,检测显示VEG-C基因和蛋白水平表达量明显降低,抑制率最高达854%,细胞体外生长缓慢,72 h后凋亡率达60%.结论:针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体能抑制VEGF-C的基因表达.促进了人乳腺癌细胞MDA-MB-435的凋亡,可进一步发挥治疗作用.     

RNA干扰对肝癌细胞乙酰肝素酶表达的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)对肝癌细胞株Hepal-6中乙酰肝素酶(HPSE)表达的抑制作用.方法 设计针对小鼠肝癌细胞Hepal-6 HPSE mRNA的小干扰RNA(siRNA),以阳离子脂质体LipofectamineTM 2000包埋后转染该细胞株,转染48 h后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测Hepal-6细胞HPSE mRNA及蛋白质表达的变化.结果 siRNA各组与正常对照组和阴性对照组比较,HPSE mRNA和蛋白质的表达均受明显抑制(P<0.01),并且呈剂量依赖性.结论 HPSE siRNA可显著抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6中HPSE mRNA和蛋白质的表达.     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

小干扰RNA下调Notch-1基因的表达对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响

目的 观察Notch-1信号通路在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞MDA-MB-231增殖中的作用,并探讨其分子机制.方法 运用小干扰RNA(siRNA)转染技术,下调MDA-MB-231细胞中Notch-1 mRNA表达,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测干扰后5d的细胞增殖,并用流式细胞术检测干扰48 h后细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化.另外应用实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot法检测siRNA转染前后Notch-1、细胞周期素D1( Cyclin D1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、bcl-XL mRNA变化及细胞核中核因子(NF)-κB蛋白的变化.结果 N0tch-1 siRNA可有效降低细胞中Notch-1 mRNA表达;转染后细胞增殖能力明显受到抑制,第5天的抑制率达到44.7％,细胞凋亡率由3.67％增加到13.25％,细胞周期G2期由6.27％增加到14.28％.进一步研究结果显示siRNA介导的Notch-1下调,可使细胞核内NF-κB蛋白表达降低,细胞中Cyclin D1、bcl-2、bcl-XL mRNA 表达下调.结论 Notch-1信号通路在TNBC中发挥重要作用,siRNA下调Notch-1可有效抑制MDA-MB-231细胞增殖,Notch-1是TNBC潜在的新治疗靶点.     

转染ERα基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞白细胞介素-8表达的影响

目的 通过转染GFP-C1-ERα质粒建立稳定表达ERα的MDA-MB-23l细胞株,观察ERα对该细胞株白细胞介素(IL)-8表达的影响.方法 pEGFP-C1-ERα质粒经酶切和测序后转染MDA-MB-231细胞,使用G418筛选出稳定表达的克隆并鉴定.使用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定稳定转染ERα的MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231细胞及MCF-7细胞的IL-8mRNA的表达,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定细胞上清液IL-8的浓度.结果 成功建立ERα阳性表达的MDA-MB-231细胞株,转染ERα的细胞株IL-8 mRNA的合成(105±16)ng/L明显低于MDA-MB-231细胞(195±32)ng/L(P<0.05),但仍然高于MCF-7细胞(32±4)ng/L(P<0.05),转染后细胞上清液IL-8浓度较未转染细胞明显降低,分别为(3499±312)ng/L和(6788±427)ng/L(P<0.05),但仍然高于MCF-7细胞(1846±44)ng/L(P<0.05).结论 稳定转染ERα基因抑制了MDA-MB-231细胞的IL-8的合成和分泌.     

反义RNA抑制Ezrin表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的 观察特异性阻断Ezrin的表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵袭能力的影响.方法 将anti-pCR3.1-Ezrin质粒经脂质体介导,转染人人乳腺癌细胞MDA-MB-231 6、12和24 h,应用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ezrin的表达变化情况;转染质粒24h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231和MCF-7细胞体外增殖能力的影响,Boyden小室法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231和MCF-7细胞体外侵袭能力的影响.结果 转染anti-pCR3.1-Ezrin后,对MDA-MB-231细胞中的Ezrin表达抑制在24 h时达高峰.MTT法比色实验结果显示,MDA-MB-231和MCF-7细胞中转染anti-pCR3.1-Ezrin组、转染空质粒组和对照组的A值分别为0.410±0.018、0.765±0.058、0.795±0.061和0.480±0.021、0.632±0.052、0.648±0.059.转染anti-pCR3.1-Ezrin组细胞的增殖受到明显抑制,抑制率分别为(47.9±3.1)%和(32.0±2.8)%(P<0.05).Boyden小室法检测结果显示,MDA-MB-231和MCF-7细胞中转染anti-pCR3.1-Ezrin组细胞的侵袭能力分别为对照组的(50.5±3.2)%和(74.8±4.6)%(P<0.05).结论 Ezrin在乳腺癌的生长和侵袭过程中发挥重要作用.     

慢病毒介导CCL5-siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨CCL5-siRNA对高转移性人乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 合成特异性CCL5-siRNA并克隆入慢病毒表达载体pGCSIL-GFP,将重组CCL5-siRNA慢病毒感染高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231设为KD组,另设阴性对照组和未感染组;分别采用实时定量聚合酶链反应和Western blot方法检测CCL5-siRNA对CCL5表达的作用;用噻唑蓝比色法、流式细胞术、克隆形成试验和Boyden小窒穿透试验观察细胞的增殖、周期、体外聚集和侵袭力的改变.结果 CCL5-siRNA慢病毒可显著降低MDA-MB-231细胞CCL5的表达,改变细胞形成克隆和运动侵袭的能力,但对细胞增殖的影响不明显.与阴性对照组(1.00±0.07)和未感染组(0.88±0.15)比较,KD组细胞CCL5 mRNA的表达下降为(0.18±0.03),P<0.01.在上样量相同的条件下,与阴性对照组(1.82±0.18)比较,KD组CCL5蛋白表达降低为(0.33±0.13),P<0.01.细胞克隆计数:与阴性对照组(0.97±0.09)和未感染组(1.04±0.07)比较,KD组细胞的克隆数降为(0.33±0.10),P<0.05;穿膜细胞计数:KD组(38±15)明显少于阴性对照组(77±11)和末感染组(69±9),P<0.05.嚷唑蓝比色实验和流式细胞分析提示:KD组细胞的增殖情况与阴性对照组、未感染组相比无明显差别.三组PI值分别为0.48±0.02、0.44±0.05及0.47±0.02(P>0.05).结论 慢病毒介导的CCL5-siRNA可显著抑制高转移性人乳腺癌细胞的克隆形成和运动侵袭能力,但对其增殖活性无明显影响.     

靶向MUC1的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对黏蛋白1(MUC1)特异性的siRNA表达载体。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状MUC1-siRNA的寡核苷酸链,将其插入pGCsilencerTMU6/Neo/RNAi质粒载体中,用双酶切、阳性克隆聚合酶链反应(PCR)鉴定及DNA测序鉴定所构建的重组载体是否正确;以脂质体法将构建的重组载体导入人胆管癌细胞QBC939中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测转染细胞中MUC1mRNA和蛋白的表达。结果双酶切、PCR鉴定及DNA测序证实MUC1-siRNA真核表达载体构建成功,转染该载体后的QBC939(干扰组)中MUC1mRNA及其蛋白质表达水平明显下调(P0.05)。结论成功构建的特异性siRNA表达载体,转染QBC939后可特异性地封闭MUC1的表达,为进一步研究MUC1-siRNA载体提供了实验基础。     

Smad3小分子干扰RNA在乳腺癌细胞中抑制转化生长因子-β诱导的基质金属蛋白激酶-9的表达

目的 观察应用Smad3特异性小分子干扰RNA(siRNA)在乳腺癌MDA-MB-231细胞中对MMP-9表达的影响.方法 化学合成Smad3 siRNA,并将其转染到MDA-MB-231细胞后行转化生长因子(TGF)-β(1μg/L)刺激.24 h后利用萤光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子(4xSBE)的活性;48 h后应用Western blot法测定Smad3、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白水平表达;24 h后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法观察MMP-9 mRNA水平表达.结果 与对照组比较,Smad3 siRNA有意义地抑制Smad3蛋白的表达(0.5±0.1比1.0±0.2).Smad3 siRNA有意义地抑制TGF-β诱导的4xSBE活性(5.2±0.3比1.0±0.1;P＜0.05).Smad3蛋白的表达(0.5±0.1比1.0±0.2)与对照组比较TGF-β刺激组明显激活了MMP-9 mRNA和蛋白水平的表达(2.4±0.3比1.0±0.1和1.8±0.4比1.0±0.2),而Smad3 siRNA有意义地抑制了TGF-β激活的MMP-9mRNA和蛋白水平的高表达(1.3±0.2比2.4±0.3和1.1±0.2比1.8±0.4).结论 构建的Smad3siRNA能够抑制MDA-MB-231细胞中TGF-β诱导的MMP-9的表达.     

靶向Survivin的siRNA联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖

目的 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体,观察其对吉西他滨化疗抑制胰腺癌Pane-1细胞增殖的影响.方法 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体psiRNA-Survivin,行酶切和测序鉴定.用重组质粒转染Pane-1细胞并筛选稳定转染的细胞株,绘制细胞生长曲线.采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测Survivin的mRNA和蛋白表达变化.以吉西他滨分别作用于对照组和转染组Panc-1细胞24 h,噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 酶切和测序鉴定表明,成功构建了psiRNA-Survivin重组质粒.重组质粒稳定转染胰腺癌细胞株后,Survivin的mRNA和蛋白表达分别下调了79.2%和83.6%(P<0.05),生长曲线明显变平缓,并能显著增强吉西他滨对Panc-1细胞的增殖抑制[(24.6±4.5)%/(38.7±5.2)%]和凋亡诱导作用[(16.7±2.5)%/(26.8±3.4)%,P<0.05).结论 构建Survivin的siRNA表达载体可明显下调Survivin的表达,抑制Panc-1细胞增殖,并能提高细胞对吉西他滨的化疗敏感性.     

蛋白酶体激活因子REG gamma基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响

目的 观察蛋白酶体激活因子REGgamma(REGy)基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响.方法 构建真核表达重组体PcDNA3.1-REGy并将其以脂质体转染法导入细胞,以600 mg/L浓度的G418连续筛选转染细胞6周,获得稳定高表达该基因的细胞株.分别以噻唑蓝(MTT)、流式细胞仪(FCM)、软琼脂集落形成试验检测其对细胞生长的影响.免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 转染REGy/的细胞有外源REGy/基因的整合及表达,经Western blot检测其表达较未转染组和仅转染空载体组明显增加.MTT法检测发现转染REGy细胞生长加速;FCM检测提示转染REGy组、未转染组和仅转染空载体组在S+G2+M增殖期的细胞比例分别为55.91%、44.09%、43.69%;软琼脂集落形成试验显示其平均集落形成率分别为10.23%、3.67%、4.06%.转染REGy/基因后PCNA表达明显增强.结论 转染外源野生型REGy基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有加速其生长、促进其增殖的作用.     

Cathepsin K基因siRNA的筛选及其质粒载体的构建

目的筛选出对人Cathepsin K（CTSK）基因抑制效率最高的1对siRNA,并通过质粒载体表达该siRNA,为进一步抑制去分化人软骨细胞中CTSK的表达奠定基础。方法针对CathepsinK基因设计4个靶位点,并根据靶位点合成4对siRNA．并转染人软骨细胞。通过Real-timePCR检测4对siRNA中抑制效率最高的1对,与线性化的PGCsilencer-H1／Neo／GFP连接、转化、扩增与纯化质粒。结果4对siRNA转染软骨细胞后72h,通过对照FITC-siRNA的绿色荧光观察．siRNA的转染效率达到70％～80％。Real-timePCR检测每对siRNA的CTSK量与对照组比的百分率得到其抑制效率,分别为：第1对的比值大于对照组（无抑制作用）,第2对47．5％,第3对53．1％,第4对67．3％（抑制效率最大）。成功构建出pGCsilencer^TMH1／Neo／GFP／CTSKRNAi载体,经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100％正确。结论成功构建了CTSK基因的siRNAs表达质粒,为进一步研究抑制该基因表达对延缓软骨细胞的去分化过程并促进其成软骨能力奠定了基础。