pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006—03／2007—06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2．0～2．5kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24h在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24h后，在倒置荧光显微镜488am蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞.目的:探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达.设计:单一样本观察.单位:大连市干细胞与组织工程研发中心,大连医科大学基础医学院生化室.材料:实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成.新西兰大白耳兔,5月龄,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒.同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定.真核表达质粒经酶切鉴定后,采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞.并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标:表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定.结果:实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因,并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接.经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后,在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察,pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光,未经转染的细胞未见发出绿色荧光,说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体.     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18-20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.Lipofectamine~(TM)2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine~(TM)2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达.结果:质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度.流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.     

脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景:自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫摹因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷.胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)即可产生强大的旁观者效应.目的:观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达.设计、时间及地点:细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成.材料:SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供.连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供.LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品.方法:取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行Xhol和BamHI双酶切,用于转染.取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞恳液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达.结果:质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0～1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度.细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性.pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强.结论:脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值.     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的构建及效应

背景:体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤.目的:构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质千细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用.方法:构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定.全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞,G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达.Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24 h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72 h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况.结果与结论:构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达.BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01).结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用.     

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景：转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的：探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法：分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论：慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%（P〈0.05）。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。     

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P<0.05)。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。     

pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞

背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因.目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子牛物学实验室完成.材料:良种新两兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2.EGFP.BMP-2由奉校分子生物学实验室构建、保存.方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞.采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞.主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性.结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞.呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达.转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112 kb条带,大小与预期相符合.Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物.免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号.结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达.     

携带双报告基因真核表达载体pHSV1-TK-IRES2-EGFP在小鼠骨髓间充质干细胞内的表达

背景：单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（herpes simplex virus 1-thymidine kinase,HSV1-TK）与绿色荧光蛋白（EGFP）双报告基因共表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞内的表达研究报道较少。目的：构建pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,并检测其在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内的表达。方法：应用聚合酶链式反应从质粒pHSV106中扩增出HSV1-TK基因后与pMD18-T载体连接,构成重组质粒pHSV1-TK/18T。重组质粒以限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ进行双酶切,将其插入同样双酶切处理的pIRES2-EGFP载体内;并将新构成的重组质粒pHSV1-TK-IRES2-EGFP以脂质体法转染小鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论：酶切鉴定结果表明,扩增的HSV1-TK基因序列正确,大小为1130bp;重组质粒载体内的HSV1-TK序列与GeneBank报告的序列完全一致;骨髓间充质干细胞转染后在荧光显微镜下可以观察到有特异性绿色荧光出现,HSV1-TK的mRNA有表达。实验成功构建了pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内能有效的表达。     

携带双报告基因真核表达载体pHSV1-TK-IRES2-EGFP在小鼠骨髓间充质干细胞内的表达

背景:单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpes simplex virus 1-thymidine kinase,HSV1-TK)与绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因共表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞内的表达研究报道较少。目的:构建pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,并检测其在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内的表达。方法:应用聚合酶链式反应从质粒pHSV106中扩增出HSV1-TK基因后与pMD18-T载体连接,构成重组质粒pHSV1-TK/18T。重组质粒以限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ进行双酶切,将其插入同样双酶切处理的pIRES2-EGFP载体内;并将新构成的重组质粒pHSV1-TK-IRES2-EGFP以脂质体法转染小鼠骨髓间充质干细胞。结果与结论:酶切鉴定结果表明,扩增的HSV1-TK基因序列正确,大小为1130bp;重组质粒载体内的HSV1-TK序列与GeneBank报告的序列完全一致;骨髓间充质干细胞转染后在荧光显微镜下可以观察到有特异性绿色荧光出现,HSV1-TK的mRNA有表达。实验成功构建了pHSV1-TK-IRES2-EGFP真核表达载体,在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞内能有效的表达。