调肝益气通络方药物血清诱导骨髓间充质干细胞转化为肝细胞的研究

目的探讨调肝益气通络方诱导大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem cells,MSC）向肝细胞定向分化的能力。方法分离、纯化并鉴定大鼠骨髓MSC,制备肝纤维化大鼠模型,灌胃调肝益气通络方后提取药物血清,用含药血清,对照肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）诱导MSC向肝细胞的分化若干天后;进行相关指标检测。结果1．各浓度含药血清在加入1、7、14d后,其细胞数量均显著多于常规培养组。2．含药血清诱导MSC分化7d后,高剂量组甲胎蛋白（Alpha Fetopmtein,AFP）与白蛋白（Albumin,ALB）的阳性细胞率均显著高于HGF组,角蛋白18（Cy—tokeratin 18,CK18）的阳性细胞率与HGF组差异无统计学意义。诱导MSC分化14d后,高剂量组AFP、ALB、CK18的阳性细胞率显著高于HGF组。结论调肝益气通络方具有诱导MSC分化为肝细胞的能力。     

血府逐瘀汤含药血清对MSC分化过程中α-MHC和β-MHC mRNA表达的影响

目的：探讨中药复方血府逐瘀汤含药血清体外诱导骨髓间充质干细胞（MSC）向心肌细胞分化的情况．为MSC移植治疗缺血性心脏病提供安全有效的种子细胞。方法：分离培养Wistar大鼠MSC,用血府逐瘀汤含药血清诱导后,RT-PCR技术检测诱导后的MSC心肌细胞标志物α-MHC、β-MHC的表达。结果：MSC经过血府逐瘀汤含药血清体外诱导后,细胞中有心肌细胞标志物α-MHC、β-MHC的表达。结论：中药复方血府逐瘀汤含药血清可以体外诱导大鼠MSC分化为心肌样细胞。     

中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究

目的研究中药复方牛黄、西洋参（简称牛黄参）含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344增殖、分化的影响,探讨益气解毒法体外诱导肝干细胞分化为肝细胞的内在机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;噻唑兰（MTT）比色法检测不同浓度含药血清对WB-F344增殖的影响;取增殖的最佳浓度,蛋白印迹法（western blot）检测含药血清对WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测含药血清对WB-F344肝细胞表面标志物白蛋白（ALB）的mRNA表达的影响。结果牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;能刺激WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量上调（P〈0.01）;能促进WB-F344肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达（P〈0.01）。结论牛黄参含药血清可以通过细胞因子体系对肝干细胞WB-F344的增殖、分化进行调节,为利用中药复方制剂调控肝干细胞,促进肝再生和肝损伤修复提供实验与理论基础。     

补肾中药成分配伍调控RUNX2、OSX对大鼠BMSCs成骨分化的影响

目的观察补肾代表中药淫羊藿、补骨脂、女贞子、何首乌有效成分对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及向成骨细胞定向分化的影响。方法将65只SPF级SD雌性大鼠随机分为正常对照组、阳性转化液对照组、补肾中药配伍组(补肾中药1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组)、非补肾中药对照组(黄芪甲苷组、川芎嗪组)。通过血清药理学方法,对实验大鼠连续灌胃给药3 d后,取材获得含药血清,使用各组大鼠含药血清培养骨髓间充质干细胞6 d、12 d、18 d;用茜素红染色对钙化结节进行成骨细胞鉴定;应用MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖率,酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,用实时定量PCR法检测核心结合蛋白因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)的基因表达。结果补肾中药有效成分不同配伍含药血清作用于体外培养骨髓间充质干细胞72 h,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖。ALP在12 d达到高峰值。Real-Time PCR结果显示补肾中药有效成分能上调RUNX2、OSX的基因表达。结论补肾中药有效成分配伍能提高骨髓间充质干细胞增殖率,促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,其机制与补肾中药有效成分配伍能上调RUNX2、OSX的基因表达相关。     

龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

【目的】观察龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力。【方法】采用龟板含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NFP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。【结果】成年大鼠骨髓间充质干细胞受龟板血清诱导后神经元样细胞NF表达阳性，诱导后12h，神经元样细胞NF阳性表达达到高峰。【结论】龟板含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元。     

牛黄参含药血清对肝干细胞WB-F 344增殖和凋亡的影响

目的研究牛黄参含药血清对大鼠肝干细胞WB-F344增殖及凋亡的影响,探讨益气解毒法诱导肝干细胞的作用机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测细胞的增殖,取药物血清的最佳增殖浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经牛黄参含药血清干预后,MTT检测结果显示10%、20%浓度的牛黄参含药血清均能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;10%牛黄参含药血清作用的WB-F344细胞凋亡率与空白、正常对照组相比显著下降（P〈0.01）,且以10%牛黄参含药血清成分组效果最佳。结论牛黄参含药血清可在一定程度上促进WB-F344细胞的增殖,抑制其凋亡,这可能是益气解毒法作用于肝干细胞的机制之一。     

SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的观察鞘氨醇激酶-1（SPK-1）基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。     

加味小柴胡汤含药血清对大鼠肝星状细胞增殖和结缔组织生长因子表达的影响

目的：探讨加味小柴胡汤含药血清对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖和结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法：①含药血清的制备：将Wistar大鼠随机分为大剂量组、中剂量组、小剂量组、对照组，各10只。各组分别给予蒸馏水或相应剂量的加味小柴胡汤灌胃，1次/d，共5 d。于末次给药2 h后经腹主动脉采血，制备相应剂量的含药血清。②含药血清对rHSC-99细胞增殖和CTGF表达的影响：用0.1%胰蛋白酶消化生长接近汇合的rHSC-99细胞，接种于培养板中，分为大剂量组、中剂量组、小剂量组和对照组。培养24 h和48 h后，采用MTT法检测含药血清对rHSC-99细胞系增殖的影响、免疫细胞化学染色检测细胞因子CTGF的表达、RT-PCR检测CTGF mRNA的表达。结果：不同浓度的加味小柴胡汤含药血清对HSC的增殖有明显的抑制作用，并可显著抑制CTGF蛋白和CTGF mRNA的表达。结论：加味小柴胡汤通过抑制HSC的增殖、抑制CTGF的表达而发挥其抗肝纤维化的作用。     

龟鹿二仙胶对地塞米松诱导骨髓间充质干细胞损伤的保护作用

目的 研究龟鹿二仙胶对地塞米松诱导骨髓间充质干细胞损伤的保护作用。方法 体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,传至第二代后分5组培养:正常组、地塞米松（10-8mol/L）组、骨化三醇含药血清组、龟鹿二仙胶含药血清低剂量组、龟鹿二仙胶含药血清高剂量组。MTT法检测骨髓间充质干细胞活力,检测细胞上清中的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、炎症因子白介素-6（IL-6）、小鼠白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。采用Western blot检测Nrf-2/HO-1/NF-κB信号通路蛋白表达。结果 龟鹿二仙胶能显著提高细胞活力,增加SOD水平、降低MDA水平、降低炎症因子水平,增加蛋白Nrf-2、HO-1蛋白表达水平,降低NF-κB信号蛋白表达。结论 龟鹿二仙胶对地塞米松诱导骨髓间充质干细胞损伤有保护作用,且作用与调控Nrf-2/HO-1/NF-κB信号相关。      

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法：应用贴壁筛选法分离培养Wistar大鼠髓间充质干细胞,用直接荧光抗体染色法对培养的细胞进行鉴定。结果：体外培养的原代MSC 9d融合,荧光抗体染色CD44、CD105表达阳性,CD14、CD34表达阴性。结论：贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增MSC,可作为获得MSC的一种有效手段。     

补肾方含药血清对人肝癌SK-HEP-1细胞增殖与凋亡的影响

目的:评价补肾方含药血清对人肝癌细胞株SK-HEP-1细胞增殖和细胞凋亡的影响,探讨其作用机制。方法:用SD大鼠制备空白组、补肾组、索拉非尼组含药血清;培养并建立VEGF诱导的SK-HEP-1细胞模型,分别予药物血清干预。以MTT比色法检测各组对SK-HEP-1细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡,荧光Real-time PCR法检测细胞凋亡基因bax mRNA、bcl-2 mRNA的表达。结果:与空白血清组和VEGF组比较,补肾组含药血清可明显抑制SK-HEP-1细胞增殖(P0.01),提高SK-HEP-1细胞G1期的细胞比率(P0.05)以及细胞的早期凋亡率(P0.05)和总凋亡率(P0.05),上调bax mRNA基因表达(P0.05)和下调bcl-2 mRNA基因表达(P0.01),且补肾组和索拉非尼组组间差异无统计学意义(P0.05)。结论:补肾方对人肝癌细胞株SK-HEP-1具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用;其作用机制可能与阻滞细胞由G1期进入S期和G2期,以及上调bax和下调bcl-2基因表达,促进SK-HEP-1细胞的凋亡有关。     

鼠龄对大鼠骨髓干细胞生长情况的影响

目的研究鼠龄对骨髓间充质干细胞(MSCs)生长情况的影响。方法用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化不同鼠龄的MSCs,传代扩增,测定生长曲线,进行形态学观察。结果 3d鼠和1月龄鼠MSCs的增殖能力显著高于6月龄和12月龄鼠,而3 d鼠与1月鼠MSCs的增殖能力无明显差异。结论 3 d鼠和1月龄鼠比6月龄鼠、12月龄鼠,更适于MSCs的提取、移植。     

龟板含药血清对大鼠骨髓间质干细胞体外增殖的影响

[目的]观察益肾中药龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖的影响。[方法]使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,分别从光学显微镜下的形态学特征、免疫细胞化学染色后的MSC表型特征、四甲基偶氯唑盐(MTT)染色后MSC的吸光值以及以Brdu、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色后MSC的阳性细胞数变化等角度观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC的生长变化。[结果]不同浓度的龟板血清均以浓度依赖方式促进MSC增殖活力和增加Brdu、PCNA阳性细胞数,与对照组比较具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。[结论]龟板血清可促进MSC的增殖而有利于细胞脱氧核糖核酸(DNA)合成,推测这可能是龟板补肾的机理之一。     

益气活血化痰中药复方对大鼠胚胎神经干细胞生长分化增殖的影响机制研究?

目的研究益气活血化痰药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化增殖的影响。方法细胞分为空白血清组、含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组和培养基对照组5组。采用细胞培养、血清药理学、免疫荧光等技术,观察中药复方血清对大鼠NSC生长分化的影响;相差显微镜进行形态学观察;免疫荧光染色技术,检测各组细胞nestin、神经元特异性烯醇化酶(NES)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察神经干细胞的分化。结果益气活血化痰中药对神经干细胞无毒性,并能够促进神经干细胞生长分化。nestin蛋白在诱导分化24 h内表达最强,诱导72 h后nestin表达明显减弱直至消失。益气活血化痰中药组NES和GFAP阳性细胞数明显增加。结论益气活血化痰药物血清有促进NSC生长分化增殖的作用。     

益气活血通络汤治疗脑梗死后遗症133例临床观察

目的：观察益气活血通络汤治疗脑梗死后遗症的临床疗效。方法：133例脑梗死后遗症患者均应用益气活血通络汤并结合推拿按摩治疗,治疗90d后观察临床疗效。结果：133例患者中基本痊愈76例,显著进步43例,进步13例,无变化1例,总有效率为99．25％。结论：益气活血通络汤治疗脑梗死后遗症疗效显著,未发现明显毒副作用,值得临床推广应用。     

全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的方法,研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC,体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;利用四唑盐比色（MTF）法测定MSC的生长曲线;流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜抗原。结果原代分离的MSC在接种后48h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期,3天后进人生长期,7天后进入平台期。FCM检测CIM5、CD90阳性率分别为19．60％、95．38％。结论贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。     

益气化瘀补肾方对退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响

目的：观察益气化瘀补肾方血清对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响。方法：取6例确诊为脊髓型颈椎病的住院患者行颈椎减压融合手术摘除的退变椎间盘组织块,采用组织块法培养原代细胞;SD大鼠10只,灌胃制备大鼠益气化瘀补肾方含药血清。取传代第1代的退变椎间盘细胞,分为益气化瘀补肾方含药血清高浓度组（20%）、中浓度组（10%）、低浓度组（5%）及相应体积比浓度氯化钠溶液血清对照组。MTT法检测不同浓度的益气化瘀补肾方血清对椎间盘细胞增殖的影响,实时荧光定量聚合酶链反应检测不同给药时间点各组椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA的表达。结果：第1代退变椎间盘细胞传代第6天时细胞增殖达到顶峰,8d后开始下降,故选择细胞传代第6天为给药干预时间点。与对照血清比较,不同浓度的益气化瘀补肾方血清可促进退变椎间盘细胞的增殖（P〈0.01）,提高退变椎间盘细胞蛋白聚糖mRNA的表达（P〈0.01）,并下调Ⅹ型胶原mRNA的表达（P〈0.01）,且以中浓度的作用最为明显（P〈0.05）。结论：益气化瘀补肾方通过调节退变椎间盘的胶原及蛋白多糖的表达而产生有效防治脊髓型颈椎病椎间盘退变的作用。     

调衡方对Lewis肺癌细胞增殖及JAK—STAT信号通路的影响

目的：观察调衡方对Lewis肺癌细胞增殖凋亡及JAK-STAT通路的影响。方法：实验动物分为4组,灌服给药,制备调衡方小、中、大剂量含药血清,正常血清。又将细胞分为5组,即正常血清组（不含药血清）,小、中、大剂量含药血清组,中剂量含药血清＋AG490（JAK-STAT信号通路特异性抑制剂）干预组,分别孵育Lewis肺癌细胞株24 h后,MTT法检测对Lewis肺癌细胞增殖的影响,吖啶橙染色观察Lewis肺癌细胞凋亡状况,RT-PCR法检测其对Lewis肺癌细胞Stat3、Stat5 mRNA的影响。结果：Lewis肺癌细胞经调衡方中、大剂量含药血清作用后,与对照组比较,细胞内Stat3含量降低至0.622±0.004、0.62±0.007（P〈0.01）,Stat5表达分别降低至0.700±0.034、0.649±0.033（P〈0.01）。结论：调衡方含药血清能显著抑制Lewis肺癌细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与下调stat3、stat5的基因表达,抑制细胞信号转导通路有关。     

骨髓间充质千细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化,鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC,由门静脉注入肝移植受体,取肝组织冰冻切片,观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC,并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d,可在体外传代20代以上,具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100％。荧光显微镜观察。可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高,生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。