抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 运用杂交瘤技术制备抗血红蛋白(hemoglobin, Hb)单克隆抗体,为进一步探讨Hb在帕金森病中的发病机制及早期诊断中的意义奠定基础。方法 用重组人Hb作为抗原免疫Balb/c小鼠,并将其脾细胞与同系骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤,经3次有限稀释法及酶联免疫吸附试验法筛选获得抗人Hb单克隆抗体杂交瘤株5B1。腹腔注射于免疫抑制Balb/c小鼠产生腹水,并利用Dot blotting、酶联免疫吸附实验,免疫共沉淀、Western blotting法及免疫组织化学染色法进一步测定抗体效价,获得一特异性抗Hb单克隆抗体。结果 成功制备出1株高亲和力、特异性好的抗Hb单克隆抗体。结论 制备的单克隆抗体对Hb具有特异性(包括人血、猴及小鼠),为进一步研究Hb在帕金森病(Parkinson's disease,PD)中的作用提供了有力的特异性工具。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法。方法 用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力。用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG₁,亲和常数(κ)介于1×10^-8~2.82×10^-10。以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗氯霉素单克隆抗体的制备、纯化及其特异性鉴定

目的：获得能稳定分泌高亲和力抗体的抗氯霉素杂交瘤细胞。方法：重氮化法偶联制备氯霉素（CAP）的免疫抗原和检测抗原（CAP-BSA和CAP-OVA）。应用常规技术融合,三次有限稀释克隆和间接竞争ELISA法筛选杂交瘤细胞株,并鉴定抗体特异性。结果：得到一株能够稳定分泌高亲和力,特异性强抗体的杂交瘤细胞株4B12,辛酸-硫酸铵法纯化体内诱生法制备的腹水;纯化后的抗体效价>1∶256 000,杂交瘤细胞染色体平均数为50±2,分泌的抗体属于IgG₁亚类,相对分子质量为157.92 ku,亲和常数为8.26×10⁸M^-1;与甲砜霉素、庆大霉素、泰乐菌素、青霉素、链霉素和卡那霉素无交叉反应。结论：该细胞株可满足建立免疫学检测方法的需要和开发应用的要求。     

人降钙素原的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的: 原核表达人降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,制备高纯度的PCT单克隆抗体。方法: 将构建的PCT-pET22b表达载体转入大肠埃希菌BL21中诱导表达PCT蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化,用蛋白质印迹法和胶体金法对其进行鉴定。获得的PCT重组蛋白采用长程免疫法皮下多点注射Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,筛选阳性杂交瘤细胞株并进行亚克隆4次。将细胞株注入小鼠腹腔收集腹腔积液获得单克隆抗体,经辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法进行纯化。结果： SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量约14 kDa处有一明显条带,与目的蛋白大小相符。蛋白质印迹法和胶体金法证明该可溶性蛋白为PCT。采用细胞融合技术成功筛选出7株阳性杂交瘤细胞,将其命名为B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2。选B3和C4细胞株通过体内诱生法制备单克隆抗体,经纯化后纯度可达95%以上。间接ELISA法检测B3、C4抗体效价均可达10⁷,亲和常数分别为5.06×10⁸,7.3×10⁸。结论： 获得高纯度的PCT重组蛋白及其单克隆抗体,为PCT检测试剂盒的进一步研究提供了支持。     

与海洛因有完全交叉反应的抗吗啡单抗的制备

目的 制备吗啡的单克隆抗体(mAb)并鉴定抗体的特性。方法 6-琥珀酰化吗啡与Bluecarrier(BC)载体蛋白交联制备6-琥珀酰化吗啡酯(M-6-S-BC),用其免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤,经筛选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果 获得4株杂交瘤细胞G1、G3、H4和B1,其分泌单抗的亚型均为IgG1型。经ELISA鉴定,该单克隆抗体可结合游离的吗啡、海洛因及可待因,而且对海洛因的结合优于吗啡,该单抗不与非阿片类药物结合。结论 所制备的吗啡单克隆抗体可特异性结合吗啡等阿片类药,将为建立体外吗啡及海洛因的非同位素检测方法奠定基础。     

人骨髓间充质干细胞表面抗原单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备人骨髓间充质干细胞(MSCs)的特异性细胞表面抗原的单克隆抗体.方法以人骨髓MSCs为抗原,常规方法免疫Balb/c小鼠,细胞融合制备杂交瘤细胞,并用免疫荧光法在流式细胞仪上对杂交瘤产生的抗体进行初测和复测.结果通过分泌的抗体与人MSCs表面抗原特异性结合的鉴定,进行杂交瘤筛选,将复测为阳性的克隆连续克隆化培养,获得两株持续分泌抗人MSCs的杂交瘤细胞株:8g8、8f9.两株单抗经体外连续传代培养,生长良好,稳定分泌抗体.结论人骨髓MSCs的特异性细胞表面抗原单克隆抗体可望在MSCs的提纯和体外富集、特异性骨病的诊断等方面有广阔的应用前景.     

抗马尔尼菲青霉单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗马尔尼菲青霉单克隆抗体(mAb)。方法用基因重组马尔尼菲青霉甘露糖蛋白1(MP1)抗原免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株稳定分泌抗马尔尼菲青霉mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定均为IgG1,抗体亲和常数分别为8.2×10-9、4.7×10-9、6.5×10-9和2.7×10-9,免疫印迹证实马尔尼菲青霉mAb特异性识别MP1。结论4个杂交瘤细胞株特异性好、亲和力高,为马尔尼菲青霉病的快速诊断奠定了基础。     

环孢霉素A合成抗原的单抗制备技术探讨

目的：研究利用自制的合成抗原制备环孢霉素A单克隆抗体的方法。方法：利用光化学反应将环孢霉素A与聚-L-赖氨酸偶联为合成抗原,免疫BALB／e小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合,经反复筛选亚克隆获得抗CsA抗体的杂交瘤细胞株,以间接ELISA法进行抗体鉴定。结果：获得4株分泌抗CsA抗体的杂交瘤细胞株,其中2株分泌的抗体效价高,有一定特异性。结论：该抗原合成和免疫的方法切实可行,但单克隆抗体制备及保存方法有待进一步改进。     

抗人ζ珠蛋白链不同表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备和鉴定抗ζ珠蛋白链单克隆抗体。方法 用纯化的重组ζ珠蛋白链免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤,经重组的ζ珠蛋白链筛选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得3株杂交瘤细胞1A12、3H9及4D11,其分泌单抗的亚型分别为IgG2a、IgG1和IgG1;双抗体夹心ELISA结果证明3株单抗均可结合重组的及东南亚(--^SEA)缺失型地中海贫血基因携带者血中的ζ珠蛋白链,且其中1A12和3H9识别的位点为不同表位。这三株抗体将为筛选地中海贫血基因携带者的免疫检测提供有力工具。     

一种制备抗复合抗原单克隆抗体的方法

OBJECTIVE: To prepare monoclonal antibodies (mAbs) against multiple antigens by single cell fusion. METHODS: BALB/c mice were immunized with the multiple antigens, namely alpha fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), HBsAgiHBcAg and HBeAg, and hybridomas were employed using PEG as the fusing agent. The hybridoma cells were respectively screened with AFP, CEA, HBsAg, HBcAg and HBeAg by enzyme-linked immunosorbent assay and limited dilution. The mAbs were purified by protein G affinity chromatography, its subtype was identified, the affinity constants (K(a)) were determined and the specificity was analyzed by Western blotting. RESULTS: Twenty hybridoma cell lines were obtained by single cell fusion, including 5 cell lines against AFP, 6 against CEA, 3 against HBsAg, 4 against HBcAg, and 2 against HBeAg. The subtypes of some hybridoma cell lines positive for the mAbs were identified as the immunoglobulin G1 (IgG1), with K(a) ranging from 1x10(9) M(-1) to x10(11) M(-1). Western blot analysis showed that all the mAbs strongly and specifically bound to their respective antigens. CONCLUSION: The mAbs against multiple antigens have been obtained by single cell-fusion, which increases the production of mAbs and reduces the time of preparation.     

乙型肝炎病毒表面抗原和抗体双阳性患者外周血T淋巴细胞亚群分布

目的 观察乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和表面抗体(HBsAb)双阳性患者外周血T淋巴细胞亚群分布。方法 以2014—2020年上海市第十人民医院和无锡市第九人民医院收治36例HBsAg和HBsAb双阳性患者为实验组,以同期无锡市第九人民医院40例HBsAg阳性、HBsAb阴性患者作为对照组。采用流式细胞术检测并比较实验组和对照组患者外周血CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞比例,采用Pearson相关分析评价患者外周血T细胞比例及血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平与血清HBsAb水平间的相关性。结果 实验组和对照组患者中位年龄、性别构成、ALT及AST水平、HBV DNA载量>10³copies/mL患者比例、HBV E抗原(HBeAg)阳性率、HBV E抗体(HBeAb)阳性率、HBV核心抗体(HBcAb)阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组和对照组患者外周血CD3⁺[(71.83±1.50)%vs(72.75±1.47)%;t=0...     

抗人肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

The hepatocellular carcinoma (HCC) cell line, QGY-7703, derived from a Chinese patient, was used to immunize the BALB/c mice. Fifteen hybridomas producing McAb that reacted with QGY-7703 cells were isolated from 858 hybridomas created in three cell fusions. In further studies two McAb, namely, AQGY1 and A-QGY2, were selected which specifically stained HCC cells grown in vitro. The reactivity of these McAb was not removed by the absorption by homogenates of the normal liver, but was by homogenates of HCC cells. A-QGY1 and A-QGY2 also reacted definitely with HCC cells in liver tissues of HCC patients, but neither with other cells in the tissues nor with nontransformed liver tissues of the same patients. Furthermore these two McAb stained the adult or fetal liver tissues, nor all of the other normal or tumor tissues that had been tested. Blocking and absorbing experiments revealed that A-QGY1 and AQGY2 antigens had no immunohomogenicity with antigens such as HBsAg, HBcAg, HBeAg, AFP and CEA. The specificity of these two McAb may be used potentially for the sero diagnosis, histologic identification, radioimmunoimaging and destruction of human hepatocellular carcinoma.     

肝细胞癌的免疫组织化学及组织病理学研究

对153例HCC外检标本进行了HBsAg及HBcAg定位观察。结果发现癌周围肝组织中HBsAg检出率为61%,HBcAg为26%。癌组织中HBsAg检出率为4.6%,HBcAg为3.9%,二者在癌组织中的总检出率为7.2%。此外对AFP、AAT、AACT及CEA进行了定位检测。癌组织中AFP、AAT检出率均为47%,AACT为71%,CEA为62%。与临床血清检测结果一致。同时还观察到LCD的出现与HBV感染有密切关系,LCD细胞中AFP、AAT、AACT及CEA的检出与癌周正常肝细胞无明显区别。     

慢性乙型肝炎肝组织HBsAg和HBcAg的免疫组化检测及其意义

应用PAP和ABC法分别对54例慢性乙肝肝组织中HBaAg和HBcAg进行检测,分析了两种抗原在肝组织中的存在状态与肝脏病理变化及血清HBV复制指标间的关系。发现肝组织中HBV抗原检出率与肝炎病变程度呈负相关(P<0.05)。三种病理类型肝组织中,HBsAg均以胞浆型为主;膜型HBsAg主要见于CAH.ASH和CPH时,HBcAg以核型表达为主,面CAH时以浆膜型为主。膜型HBsAg和浆膜型HBcAg表达区易见到肝细胞坏死及炎性细胞浸润。还发现肝组织中HBcAg的检出与血清HBcAg和HBV-DNA密切相关(P<0.005)。上述结果提示:①肝细胞损伤可能并非HBV直接作用,而是机体针对HBV的免疫反应所致;膜型HBsAg和浆膜型HBcAg可能是肝细胞免疫损伤的靶抗原。②肝组织内HBcAg的存在是HBV复制标志。     

一株具有抗HBc及抗HBs双重反应性的抗HBV单克隆抗体细胞株的选育

以富含Dane颗粒的HBV抗原作免疫原进行研究，选育出一株分泌具有抗HBc及抗HBs双重反应性McAb的杂交瘤细胞株。该细胞株经5次连续克隆化证实其克隆单一性，常规染色体检查证实为双倍体细胞（染色体89.5±3.6条），在ELISA中能与基因重组HBcAg、血源性富含Dane颗粒之HBV抗原、小圆颗粒HBV抗原及HBsAg阳性血清发生反应。对四者的反应效价大致相同，但对HBcAg的反应强度显著高于其它三者。此外还发现该McAb在改良双抗原夹心ELISA中能与桥连方式同时与HBcAg及HBsAg相结合。     

幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）CagL蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）,并鉴定其特性。方法： 用原核表达并纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠,6周后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经亚克隆筛选获得阳性杂交瘤细胞株;ELISA法鉴定mAb的亚型;间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清和腹腔积液效价及其相对亲和力;相加ELISA法分析mAb的识别表位;蛋白质印迹法鉴定mAb特异性;冻溶法检测杂交瘤细胞株的稳定性。结果： 获得3株能稳定分泌抗CagL的杂交瘤细胞株,其中两株单抗属IgM类,一株单抗属IgG2a类,轻链型别均为κ型;杂交瘤细胞培养上清效价在1∶64～1∶128之间,腹腔积液的效价均达1∶16 000以上;相对亲和力较高;3株mAb识别3种不同的抗原表位;3株mAb都能与融合蛋白反应,其中两株能与H.pylori全菌蛋白发生特异性反应;杂交瘤细胞经冻存复苏后,体外传代仍能稳定分泌mAb。结论： 成功制备了抗H.pylori CagL蛋白的单克隆抗体,为深入研究幽门螺杆菌CagL蛋白的功能和Ⅳ型分泌系统的致病机制奠定了基础。     

云南省玉溪市未抗病毒治疗HIV/AIDS患者T淋巴细胞计数自然变化

目的 探讨玉溪市未抗病毒治疗HIV感染者/艾滋病患者（HIV/AIDS）T淋巴细胞计数（CD3、CD4和CD8）自然变化,了解其艾滋病自然病程。方法 收集2006—2014年间玉溪市新报告HIV/AIDS未抗病毒治疗资料,获取首次与末次CD3、CD4和CD8数据,描述并比较CD3、CD4和CD8自然变化速率。结果 CD3、CD4和CD8月均自然变化速率分别为4.14个/μL、-2.13个/μL和7.57个/μL。其中886例（62.66%）CD4末次较首次低,表现为自然下降。首次CD4越高,其月均下降越快,而首次CD4较低,其月均下降较慢甚至出现上升,差异有统计学意义（P<0.05）。男性、汉族、≥50岁者、传播途径为注射吸毒者月均CD4自然变化下降速率较快,而女性、少数民族、50岁以下者、传播途径为性传播者CD3、CD8上升速率较快,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 玉溪市HIV/AIDS CD3、CD4和CD8自然变化总体平缓,但仍然有部分HIV/AIDS的CD4下降较快,或是CD3 、CD8上升较快,需对该类人群加强随访,及时介入抗病毒治疗。