SELEX技术筛选特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子

目的:筛选获得一种高亲和力的能特异性结合高转移性肺癌细胞Anip973的单链DNA适配子.方法:体外合成全长88 nt的单链DNA文库,通过反复的SELEX筛选获得特异性结合Anip973细胞的单链DNA适配子,并通过生物素-辣根过氧化物酶-链霉亲和素系统初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,将结合力最高的适配子库进一步...     

SELEX技术筛选HCV非结构蛋白NS3的DNA适配子

目的 用配基指数富集的系统进化技术(SELEX)技术筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的DNA适配子.方法 构建随机ssDNA文库,两端为固定序列,中间为39 nt的随机序列,总长度为85 nt,将NS3蛋白包被在96孔板上,ssDNA与NS3蛋白进行亲和反应,洗去未结合的ssDNA,洗脱回收与NS3蛋白结合的DNA,PCR扩增后,磁珠法分离成单链.重复以上筛选步骤,直至筛选出高特异性和亲和力的核酸适配子.将核酸适配子连接质粒载体克隆转人大肠杆菌,挑选阳性克隆提取质粒外送到公司进行测序.结果 通过8轮筛选,成功筛选出DNA适配子,并获得其中6条克隆的DNA一级序列.6条适配子序列长度相同,均为85 nt,两端固定序列与设计相符,中间为随机序列,随机序列无共同保守系列.所有寡核苷酸适配子的二级结构以茎环和凸环为主.结论 以NS3蛋白作为药物研究的靶点,结合SELEX筛选技术研究其核酸适配子,具有巨大的潜力和研究价值.     

利用细胞-指数式富集的配体系统进化技术筛选肿瘤细胞DNA适配子

目的建立一种通用的细胞-指数式富集的配体系统进化（Cell—SELEX）技术平台,用于筛选特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子。方法采用PCR法建立随机双链DNA（dsDNA）寡核苷酸文库,用卵白素包被的琼脂糖珠从dsDNA库分离单链DNA（ssDNA）文库;以体外培养的肿瘤细胞作为正筛选的靶标,以相同组织来源的正常对照细胞作为负筛选的靶标,消减法进行Cell—SELEX筛选和PCR扩增以获取DNA适配子;流式细胞仪监测适配子的富集效率（亲和力）;采用常规分子生物学技术进行适西亡子的克隆、测序和序列分析。结果成功建立了ssDNA库,经过12轮Cell—SELEX筛选,获得了特异性结合于肿熘细胞的DNA适配子;挑选120个阳性克隆送测序,鉴定出21个适配子,采用NCBI网站提供的B]astn程序进行精确比对末发脱相似序列。结论本实验建立的技术平台可在较短时间内获取特异性结合于特定肿瘤细胞的DNA适配子。     

适配子治疗获得性免疫缺陷综合征的研究进展

适配子(aptamer)是在体外人工合成的具有特定3级结构的单链DNA或RNA分子,从随机寡核苷酸文库中通过配体指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential Enrichment,SELEX)筛选出来,能与靶分子以高亲和力、高特异性结合。由于适配子和靶分子结合后可阻断靶分子的生物学活性,与相应抗体分子相比,适配子具有许多优越性,如分子量小、易于修饰、无免疫原性等,因而在各种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。文中就适配子治疗人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)的研究进展作一综述,以深入研究适配子对病原体感染的治疗作用。     

适配子介导转运在肿瘤靶向治疗中的研究进展

适配子是生物分子的单链寡核苷酸配体,通过指数富集的配体系统进化技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选获得。本文从连接方式、治疗靶点、疗效、优缺点多个方面对适配子介导转运在靶向肿瘤化疗、核酸治疗、光动力疗法和光热疗法中的研究进展进行概述。指出以适配体靶向肿瘤的递送系统在肿瘤相关靶向治疗中发展迅速,但仍面临许多挑战。筛选更多靶点的高亲和力适配子,改进适配子与其他治疗药物的结合模式,改善药物的药代动力学是目前工作的重点。     

核酸适配子在疾病诊断研究中的应用

核酸适配子是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)
技术从单链随机寡核苷酸文库中筛选得到的单链寡核苷酸配体，其与靶标的结合具有高特异性及高亲和力等优点，
使其能广泛地应用于疾病诊断研究。适配子在生化检测、新肿瘤标志物发现、分子成像、病原微生物检测等领域的
研究应用中均有报道，并显示出良好的应用前景。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2核酸适配子的筛选

目的获得与丙型肝炎病毒非结构蛋白NS2特异结合的高亲和力的DNA适配子。方法应用配基指数富集的系统进化(SELEX)技术进行HCV-NS2蛋白适配子筛选,将筛选得到的适配子克隆测序,应用DNAMAN软件对适配子一级结构和二级结构进行比对分析。结果重复筛选7轮后,适配子亲和力和特异性都达到最高,克隆测序得到4个适配子序列,命名为A1、A2、A3、A4,其随机序列部分分别为A1:GTGCGTCCCATGCTGCTGACTTAAATGGGTGGAGGGCAG,A2:CGTGAAATTGTTGACCACTCATGGAATCTGATCTCGTTT,A3:GAAAGGGGATAATCACTTAGGCCTCTCGAATAGTTTATC,A4:AGAAAGTTGAGAACTGCTGTTATTTTGTTAACGTACATG。经软件分析,适配子之间没有共同保守序列和同源序列,适配子的二级空间结构以茎环和口袋结构为主。结论获得了能与HCVNS2蛋白高亲和力和特异性结合的DNA适配子。     

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体.方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体.利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构.结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析.一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致.二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础.根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高.结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础.     

SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子方法的建立

目的 建立SELEX筛选LPS的适配子方法,为后续大规模筛选奠定基础.方法 在成功构建含40个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库的基础上,优化了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应条件;同时对液相筛选与固液相筛选两种方法进行比较,确定最优的筛选方法并进行4轮筛选.结果 确定了扩增为双链DNA(dsDNA)文库的PCR反应的最佳条件,采用液相筛选方法经过4轮筛选,随机单链DNA(ssDNA)文库与内毒素(LPS)的结合率明显上升,CPM值与初始库相比差异有统计学意义.结论 建立了SELEX筛选LPS寡核苷酸适配子的筛选方法.     

癌胚抗原特异性寡核苷酸适配子的体外筛选及其意义

目的:通过体外筛选获得癌胚抗原(CEA)特异性适配子,为高表达CEA肿瘤的靶向奠定基础。方法:构建长度为81 bp的随机ssDNA文库,体外筛选、富集CEA特异性适配子,通过配体介导的靶蛋白纯化实验检测经筛选的适配子与纯化蛋白结合;提取LS174T细胞总蛋白,免疫共沉淀检测经筛选的适配子与细胞总蛋白的结合。结果:经体外7轮筛选富集及筛选条件的优化,配体介导的靶标分离实验证实了筛选出的适配子与纯化CEA蛋白的结合;免疫沉淀及Westem blot证实了其识别并特异性结合天然状态的CEA。结论:经过体外7轮筛选,证实了所获得的CEA适配子可特异性地与纯化CEA和天然状态的CEA蛋白结合,为后续高表达的CEA肿瘤的靶向诊断和治疗奠定了初步的实验基础。