通过抑制ERK1/2通路诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的研究

目的应用细胞外信号调节激酶(ERK)1/2抑制剂U0126研究ERK1/2在肝癌细胞增殖、凋亡中的作用。方法以肝癌SMMC-7721细胞株为材料,分为空白对照组及不同浓度的U0126处理组。以MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡情况。结果不同浓度的U0126处理后均可明显抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖(P<0.05,P<0.01),使处于G0/G1期的细胞明显增多(P<0.05)且呈剂量依赖性,并诱发细胞凋亡发生(P<0.05)。结论阻断ERK1/2通路有可能成为肝癌治疗的重要手段。     

细胞外信号调节激酶对人血管平滑肌细胞的作用及其机制

目的观察磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)对离体培养的平滑肌细胞增殖、凋亡和表型改变的影响。方法培养人大隐静脉平滑肌细胞,实验组培养液中加入PD98059对磷酸化ERK进行阻断后,观测平滑肌细胞的增殖活性,凋亡细胞所占比例以及细胞表型,并与对照组比较。结果实验组与对照组相比,细胞增殖活性明显低于对照组(P<0.01),电镜和荧光染色测定凋亡细胞所占比例明显高于对照组(P<0.01),电镜检测合成型细胞所占比例明显低于对照组(P<0.01),收缩型细胞所占比例较对照组明显为高(P<0.01),α肌动蛋白免疫荧光化学检测显示处理组荧光表达强于对照组。结论对离体培养的人大隐静脉平滑肌细胞磷酸化ERK进行阻断后,平滑肌细胞的增殖受抑,凋亡增加,细胞由合成型向收缩型转变。     

新颖海洋化合物SZ-685C抑制GH3细胞增殖并诱导其凋亡

目的 探讨SZ-685C对大鼠垂体生长激素腺瘤细胞(GH3)系的增殖和凋亡影响. 方法 用胎鼠成纤维细胞(MEF)作为对照,MTT检测0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0和30.0 μmol/LSZ-685C对GH3细胞增殖活性影响和药物的半数抑制浓度(IC50),结晶紫染色观察不同浓度SZ-685C对GH3细胞集群生长的影响;光镜和Hoechst 33342染色观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率. 结果 SZ-685C能抑制GH3细胞的增殖,并具有浓度依赖性,IC50为(12.9±0.47)μmol/L,而作为正常对照的MEF在此浓度下,细胞增殖活性没有明显变化;SZ-685C作用GH3细胞48 h后更换完全培养基培养12d,结晶紫染色观察肿瘤细胞的集群生长仍受到明显抑制,表现为克隆数的骤减;光镜和Hoechst 33342染色观察到细胞发生凋亡的形态学证据,流式细胞的检测在不同浓度SZ-685C的作用下,细胞凋亡比例从2.0％上升至36.4％. 结论 SZ-685C能抑制GH3细胞增殖,其增殖抑制作用可能通过促进细胞凋亡的方式,加速了细胞死亡进程,为其可能作为临床新型抗垂体瘤药物提供了初步的实验依据.     

结缔组织生长因子诱导瘢痕成纤维细胞增殖的信号转导机制研究

目的：探讨结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）诱导增生性瘢痕（hypertrophics car,HS）成纤维细胞增殖的信号转导通路。方法：采用3H一胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法观察不同浓度CTGF促Hs成纤维细胞增殖的效应,以Western Blot法检测CTGF刺激HS成纤维细胞0、5、10、15、30、60min后磷酸化及总细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated kinase,ERK1／2）的表达,以二者的比值AI衡量信号通路活化程度;应用特异性阻断剂PD98059阻断ERK通路,MTT法检测CTGF诱导细胞增殖的变化。结果：CTGF在一定浓度范围内呈浓度依赖性促HS成纤维细胞增殖,ERK1／2在无CTGF刺激时AI为0．0131±0．00361,CTGF刺激HS成纤维细胞5、10、15、30、60min后的AI值分别为0．0221±0．00329,0．131±0．0361,0．209±0．0201,0．171±0．0379,0．0413±0．00361,在15min达高峰;采用P098059选择性阻断ERK1／2通路后（OD值=0．42±0．046）与CTGF刺激纽比较（OD=0．66±O．035）,细胞增殖显著受抑（P〈0．01）。结论：ERK1／2是CTGF诱导Hs戍纤维细胞增殖的主要信号通路。     

瘦素对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响及其作用机制探讨

目的 观察瘦素对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响，探讨其作用机制。方法 免疫荧光检测人乳腺癌细胞系MCF-7瘦素受体（OB．Rb）的表达。于MCF-7细胞中分别加入不同浓度的瘦素（0、10、50、100、150μg／L），作用不同的时间（6、12、24h），噻唑蓝（MTr）法检测各组细胞的增殖情况，同法分别检测STAT3抑制剂AG490和ERK1／2抑制剂PD98059对瘦素刺激MCF-7细胞增殖的影响。采用免疫印迹法（Westernblot）检测瘦素（100μg／L）作用于MCF-7细胞不同时间（0、20、40、60min）STAT3和ERK1／2的磷酸化水平。结果 免疫荧光检测证实MCF-7细胞存在瘦素受体（0B—Rb）表达。瘦素能明显促进MCF-7细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性，于100μg／L瘦素作用24h时增殖效应最大，100μg／L组与150μg/L组差异无统计学意义（P〉0．05）；不同浓度的AG490与PD98059均可明显抑制瘦素对MCF-7细胞的增殖，随着AG490与PD98059浓度增高，抑制作用逐渐增强；MCF-7细胞经100ng／ml瘦素处理后，随时间延长STAT3和ERK1／2磷酸化程度逐渐增高，且持续至少达60min。结论 瘦素可能通过激活STAT3和ERK信号通路促进入乳腺癌细胞系MCF-7的增殖。     

细胞外信号调节激酶在血管瘤组织中的表达及活性

目的:探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及其活性形式磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)在血管瘤组织中的蛋白表达及其意义。方法:应用免疫组织化学SP法,检测23例增生期血管瘤组织及19例退化期血管瘤组织ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达。结果:增生期血管瘤组织与退化期血管瘤组织ERK1/2的蛋白表达无统计学差异(Z=-0.305,P>0.05);增生期血管瘤组织p-ERK1/2的蛋白表达显著高于退化期血管瘤组织的表达(Z=-4.271,P<0.01)结论:增生期血管瘤组织p-ERK1/2呈高表达,血管瘤的增生与ERK通路的激活有关。     

孕酮和米非司酮对前列腺癌PC-3细胞作用机理的研究

目的探讨孕酮和米非司酮促进前列腺癌PC-3细胞增殖作用的机理。方法细胞培养观察孕酮和米非司酮对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响。RT-PCR检测PC-3细胞孕激素受体mRNA的表达。Westernblot检测孕酮对PC-3细胞细胞外信号调节激酶ERK1/2活性的影响,并观察米非司酮对孕酮的阻断效果。结果细胞培养7d,孕酮(100nmol/L)组细胞数量为(3.2±0.3)×105,明显高于正常培养组[(1.9±0.2)×105](P<0.05);米非司酮(10μmol/L)组为(1.3±0.2)×105,明显低于正常培养组(P<0.05)。PC-3细胞有孕激素受体mRNA的表达。孕酮可以激活ERK1/2,而米非司酮阻断孕酮对ERK1/2的激活,孕酮组与孕酮+米非司酮组p-ERK1/2条带强度差异有统计学意义(吸光度A值分别为70752±16377和12493±3478,P<0.05)。结论孕酮对PC-3细胞的促进增殖作用与激活细胞ERK1/2有关;米非司酮阻断孕酮对PC-3细胞ERK1/2的活化,从而抑制细胞增殖。     

ERK1/2 MAPK通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用。 方法 将人正义、反义TIMP-1用脂质体法转染大鼠肾小球系膜细胞，并将细胞分为正常对照组、未转染组、空载体组、正义转染组和反义转染组。各组细胞分别用高糖(25 mmol/L)和(或)MEK(ERK1/2通路中的MAPK激酶)特异性抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激24 h。应用透射电镜观察细胞内部结构变化。Western 印迹观察磷酸化(p)的ERK1/2、P90rsk、Bad及总的P90rsk、Bad、Bcl-2蛋白的表达。 结果 加入PD98059后，各组细胞内可见凋亡小体形成、细胞皱缩、核固缩、染色体边集及膜泡样突变等现象，与未转染组比较，以反义转染组最明显，凋亡细胞数目最多；正义转染组细胞形态改变不十分明显，凋亡细胞数目相对较少。此外，加入PD98059后，ERK1/2、P90rsk、Bcl-2及Bad的磷酸化明显减少(P < 0.05)，ERK1/2和P90rsk的磷酸化以正义转染组最明显(P < 0.01)；总P90rsk、总Bad表达量在各组之间无显著差异。 结论 ERK1/2 通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡过程中起重要作用。     

阻断ERK2信号转导通路对血小板源生长因子-BB诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移和表达转化生长因子-β1的影响

目的 观察ERK2信号转导通路在血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移和表达转化生长因子(TGF)-β1中的作用.方法 将原代培养的大鼠VSMC分为4组:(1)对照组;(2)PDGF刺激组;(3)Ad-LacZ组;(4)Adanti-ERK2组.用Westernblot检测细胞磷酸化ERK2蛋白水平;噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞细胞周期;Boyden小室测定细胞的跨膜迁移能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液上清中TGF-β1的浓度.结果 Adanti-ERK2组和对照组细胞增殖率、S期细胞百分比及跨膜迁移细胞数目明显低于PDGF刺激组和Ad-LacZ组(细胞增殖率:2.75%、0.00%比64.45%、61.88%;s期细胞百分比:14.18%、13.58%比38.14%、32.99%;跨膜迁移细胞数:8.2±3.2、6.3±2.6比24.8±6.1、23.3±5.8,均P<0.05);(2)Adanti-ERK2组和对照组细胞培养上清液中TGF-β1含量明显低于PDGF刺激组和Ad-LacZ组(P<0.05);而Adanti-ERK2组明显高于对照组(P<0.05).结论 ERK2信号转导通路参与调控PDGF-BB诱导的VSMC增殖、迁移和基因表达.反义ERK2基因预先转染阻断ERK信号转导能显著抑制PDGF-BB刺激的VSMC增殖、迁移,阻断细胞周期由G1期进入S期,并且部分下调TGF-β1的合成分泌.     

索拉非尼抑制人肝癌细胞耐药蛋白表达及其与氟尿嘧啶联用抑制裸鼠移植瘤生长的研究

目的 观察索拉非尼对人肝癌高转移细胞HCCLM3多药耐药蛋白表达的抑制作用及其与5-氟尿嘧啶(5-Fu)联用的协同效应.方法 使用索拉非尼和/或5-Fu对HCCLM3细胞进行干预后,应用免疫细胞化学方法、Western blot法分别检测细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)及耐药蛋白渗透性糖蛋白(P-gp)和拓扑异构酶2A(TOP-2α)的表达;将HCCLM3细胞接种于裸鼠皮下,并进行药物干预治疗,通过观察肿瘤体积的变化,评估药物对肿瘤生长的抑制作用.细胞实验及裸鼠实验均设置对照组(C)、索拉非尼组(S)、5-Fu组(F)、索拉非尼与5-Fu联用组(SF).结果 各组细胞的pERK、P-gp及TOP-2α表达分别为:C组(0.061 ±0.026、0.076±0.033、0.075±0.022)、S组(0.024±0.011、0.027±0.006、0.025±0.024)、F组(0.080±0.036、0.047±0.005、0.059±0.025)、SF组(0.027±0.015、0.022±0.019、0.038±0.020).与C组比较,S组和SF组的pERK、P-gp、TOP-2α的表达明显下降(P＜0.05).各组裸鼠皮下瘤体积(cm3)分别为:C组(5.292±1.523)、S组(1.620 ±0.784)、SF组(1.1100.402)、F组(4.327±1.709).与C组比较,S组和SF组裸鼠的肿瘤体积明显缩小(P＜0.05).结论 索拉非尼单独或与5-Fu联用能明显抑制HCCLM3细胞中pERK、P-gp、TOP-2α蛋白的表达及裸鼠皮下瘤的生长.     

PD98059对酸性成纤维细胞生长因子诱导的EJ细胞增殖的抑制作用

目的观察细胞外调节蛋白激酶(ERK)激酶MEK1抑制剂PD98059对酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)诱导的人膀胱癌细胞株EJ细胞增殖的抑制作用;探讨aFGF诱导EJ细胞增殖的细胞内信号传导途径。方法用不同浓度的aFGF刺激EJ细胞并测定ERK活性;对aFGF诱导增殖的EJ细胞施以不同浓度的PD98059,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖。结果随aFGF浓度增加,EJ细胞内ERK活性升高,当aFGF浓度为0.6 mg/L,ERK活性是对照组的223.62%; PD98059可使aFGF诱导的EJ细胞增殖比下降,当PD98059浓度为0.1μmol/L,增殖比为46.64%。结论ERK通路是aFGF诱导EJ细胞增殖的重要细胞内信号传导通路,PD98059可抑制aFGF诱导的EJ细胞增殖。     

一氧化氮对大鼠前列腺增殖/凋亡的影响

目的 探讨一氧化氮（NO）对大鼠前列腺上皮增殖／凋亡的影响。方法 20只成年雄性SD大鼠随机分为3组，第一组为正常对照组（6只），第二、三组皮下注射一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NAME（各7只），注射剂量分别为50mg／kg，2次／d及100mg／kg，2次／d。2周后观察各组大鼠前列腺重量和组织学变化，Ki-67免疫染色及TUNEL染色测定前列腺上皮细胞的增殖和凋亡指数，免疫组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测NOS3种亚型的蛋白及mRNA表达情况。结果 3组大鼠的前列腺重量差异无统计学意义（P〉0．05）；与第一组相比，第二、三组大鼠前列腺上皮细胞萎缩较明显。Ki-67及TUNEL染色显示上皮和间质细胞增殖率明显降低，上皮细胞凋亡率明显升高（P〈0．05），NOSl和NOS3蛋白及mRNA表达水平显著下降。3组NOS2表达均不明显。结论 NO可能影响前列腺细胞增殖及凋亡，在BPH的发病机理中具有重要作用。     

一氧化氮在获得性肾囊肿癌变过程中的作用

目的　探讨一氧化氮 (NO)过多产生在获得性肾囊肿 (ACDK)发生肾癌过程中的作用。　方法　用高压液相自动分析方法测定 1 6例 1 8份ACDK和 1 2份单纯性肾囊肿囊内液体中NO的代谢产物亚硝酸盐 /硝酸盐 (NO-2 /NO-3 )的含量 ,同时测定 5份ACDK患者血浆NO-2 /NO-3 的含量。采用免疫组织化学方法 (LSAB法 )检测 1 7份ACDK和 2 0例非ACDK肾组织一氧化氮合酶 (iNOS)的表达。　结果　ACDK囊内液NO-2 /NO-3 的含量 (1 5 1 .6± 6 4.2 μmol/L)明显高于单纯性肾囊肿组(5 0 .1± 33.6 μmol/L) ,差异有极显著性 (P <0 .0 0 1 )。其中在相同的 5例ACDK患者中囊内液NO-2 /NO-3 的浓度明显的高于血浆中的浓度。在免疫组织化学染色 (LSAB法 )检测肾组织iNOS的表达中 ,1 7份ACDK中 1 4例 (82 % )为阳性。 1 3例正常肾组织和 7例非ACDK慢性肾衰的肾组织均无i NOS的表达。　结论　NO在ACDK囊内液中过多产生有可能是其囊上皮发生肾癌的原因之一。     

一氧化氮介导离体犬阴茎血管及海绵体平滑肌的胆碱能性舒张

应用离体组织灌流方法，观察了犬阴茎血管及海绵体组织的胆碱能性舒张效应。结果显示，阴茎血管及海绵体组织对乙酰胆碱（Ａｃｈ）均能产生浓度依赖性舒张效应，且被左旋硝基精氨酸（ＬＮＮＡ）、亚甲蓝（ＭＢ）及阿托品抑制，说明这种舒张效应由一氧化氮介导。Ｌ－ＮＮＡ能使海绵体组织及阴部内动脉的静息张力显著上升，提示该组织中基础一氧化氮释放的存在。外源性一氧化氮能使各种组织产生完全性舒张反应，说明一氧化氮是阴茎组织强有力的舒张因子。     

缺氧诱导小鼠神经干细胞诱导型一氧化氮合酶的表达

目的　探讨缺氧对小鼠神经干细胞 (NSC)中诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)表达的诱导作用。方法　用含表皮生长因子的培养基原代培养NSC ;用免疫组织化学法检测在急性缺氧诱导下iNOS的表达 ;在每张免疫组织化学图像中随机选取 10个细胞 ,用图像分析系统分析经不同缺氧时间处理后平均灰度级变化 ,其灰度级均数间接反映酶表达强度的改变。结果　原代培养的细胞能连续增殖并分化为神经元及神经胶质细胞样细胞 ;行免疫组织化学检测 ,在一般培养条件下 ,NSC及分化细胞中iNOS呈阴性表达 ;经缺氧处理后呈阳性表达。图像分析缺氧诱导 10、3 0min与非缺氧组灰度级均数分别为 :15 8.7± 5 .95、12 8.4± 5 .73、2 0 0 .3± 5 .5 5。结论　用缺氧方法能诱导NSC表达iNOS ,其表达强度与缺氧时间呈正相关。第四军医大学西京医院全军神经外科研究所     

不同月龄大鼠阴茎组织一氧化氮合成酶活性测定及生理意义

应用离子交换层析法测定正常大鼠小脑、心脏及阴茎海绵体组织中ＮＯＳ活性，同法比较了２、１２和２４月龄大鼠阴茎海绵体组织的ＮＯＳ活性。结果显示：大鼠阴茎海绵体组织中ＮＯＳ活性水平达到小脑组织的７１．４％，是心脏组织的２．２倍，提示ＮＯＳ活性与阴茎勃起有密切关系。老龄大鼠与低月龄大鼠相比，阴茎组织中ＮＯＳ活性明显降低（２月龄对１２月龄，Ｐ＜０．０５；１２月龄，Ｐ＜０．０１），提示ＮＯＳ活性降低可能是阳萎     

Nitric oxide and superoxide in rat mesangial cells: modulation by C-reactive protein

Background: C-reactive protein (CRP) has been linked to cardiovascular and renal disease. We evaluated the effects of CRP on the production of nitric oxide (NO) and superoxide by rat mesangial cells (RMC) and the impact on cell function. Methods and Results: RMC were incubated with cytokines (IFN-γ, IL-1β, and LPS) and CRP (10–100 μg/ml) for 24–72 h. Exposure to CRP resulted in a time- and dose-dependent reduction in NO accumulation (p<0.05). Although inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein expression was unaltered after 48 h, CRP stimulated expression of HSP90. Steady state abundance of iNOS mRNA increased nearly threefold after a 24-h exposure to CRP. Incubation with 100 μg/ml CRP for 60–120 min resulted in a 272% increase in superoxide production that was prevented by diphenyleneiodium chloride but not L-NAME (p<0.0001). Conclusion: CRP enhances superoxide release in RMC, which in turn inactivates NO and reduces net production. The functional relevance of these CRP-induced changes is supported by increased expression of HSP90 in RMC exposed to the mediator. These findings suggest that systemic inflammation, which contributes to the pathogenesis of atherosclerosis, may play a role in the progression of kidney disease.     

Nitric oxide and endothelin in pathophysiological settings

The role of the endothelium, is now known to encompass the generation of many potent cytokines which impact endothelial cells, adjacent tissue such as smooth muscle cells, and distant sites in an autocrine, paracrine, and endocrine manner, respectively. This review addresses two of these cytokines, nitric oxide and endothelin, and describes how each effects the functions of endothelial cells, including regulation of platelet aggregation and coagulation, regulation of vasomotor tone, modulation of inflammation, and the regulation of cellular proliferation. The emphasis is on the increasingly recognized importance of the autocrine and paracrine mechanisms by which nitric oxide and endothelin act. In particular, autoinduction of endothelin is proposed as a central mechanism underlying endothelin's renowned effects. Additionally, specific nitric oxide/endothelin interactions are discussed by which each cytokine modulates the production and actions of the other. The net effect observed in a variety of physiological and pathophysiological settings, therefore, reflects a balance of these opposing functions.     

一氧化氮合酶在膀胱癌中的表达及临床意义

目的：探讨一氧化氮（NO）在膀胱肿瘤中的作用及临床意义。方法：采用免疫组织化学方法对58例膀胱移行细胞癌标本（实验组）及14例良性膀胱组织标本（对照组）进行一氧化氮合酶（NOS）抗体染色,观察表达结果与肿瘤生物学特性之间的相关性。结果：诱导型NOS（iNOS)在实验组中的阳性表达率明显高于对照组（P＜0．01）,其表达程度与肿瘤分级、分期无关（P＞0．05）;内皮型NOS（eNOS）在实验组和对照组血管内皮细胞都有表达,但前者表达较强;而在对照组中多呈不连续的表达。结论：NO在膀胱移行细胞癌的发生、发展中起重要的作用。