血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的大鼠骨髓基质细胞（BMCS）的表达能力及表达活性。方法取6周龄SD大鼠BMCS传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine）：1μg pc DNA3．1-VEGF165的比例转染，通过RT—PCR技术、免疫组织化学S—P法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及瞬时表达和稳定表达，用血管内皮细胞（VEC）增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果VEGF基因转染的大鼠骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌培养上清液中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论采用基因转染技术可将VEGF转染至BMCS中，并可有效表达具有生物活性的VEGF。     

鼠骨髓基质干细胞的特性及向成骨细胞的分化

目的分离纯化成年小鼠骨髓基质干细胞并进行定向诱导。方法利用Percoll液分离成年小鼠骨髓基质干细胞,Ter119、CD45磁珠纯化细胞,培养2-3代的细胞用矿化液进行定向诱导。对诱导前后的细胞进行免疫组化染色。结果 镜下见原代细胞呈多种形态。Ter119、CD45磁珠筛选可获得纯度达57.95％以上骨髓基质干细胞。碱性磷酸酶、Von Kossa染色阳性,油红染色弱阳性,矿化液诱导2周后,可形成钙结节。结论利用Percoll液结合磁珠分离法是离体条件下获得骨髓基质干细胞的一个简便有效的方法,纯化后定向诱导可得到较纯的成骨细胞。     

骨髓基质细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究

本实验观察了骨髓基质细胞(BMSCs)经化学诱导向神经细胞分化的过程,并初步探索其分化机制。首先分离培养扩增纯化SD大鼠BMSCs,应用β-巯基乙醇(BME)对第4代BMSCs进行诱导分化,分化稳定后撤除诱导液继续常规培养2周。结果显示:诱导分化前,细胞呈现梭形,平行排列生长。诱导分化后,多数BMSCs伸出突起,并发出初级和次级分支,相互交织成网状结构,成典型的神经元样细胞形态,分化过程中有部分细胞漂浮死亡。撤除诱导液常规培养2周后,分化的细胞逐渐缓慢恢复到原来成纤维细胞样长梭状形态。透射电镜观察到分化后细胞具有发育早期神经元的超微结构特点,免疫组织化学方法证实,神经干细胞标志蛋白(Nestin)在诱导分化后即开始表达,1h达到高峰,此时Nestin阳性细胞率为(29.35±1.45)%,之后随时间逐渐下降,5h时降至很低;神经元细胞标志蛋白-神经元特异性烯醇化酶(NSE)在诱导分化前不表达,在诱导分化后随时间表达逐渐增强,5h时阳性细胞率最高为(57.53±2.63)%;撤除诱导液常规培养2周时,Nestin、NSE表达均为阴性。星形胶质细胞标志蛋白-胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein GFAP)测定在不同组、不同时间点均为阴性结果。提示,BMSCs体外经BME化学诱导可向神经元样细胞分化,不能分化为胶质细胞;分化机制可能是先分化为神经干细胞,再转分化为神经元样细胞,这一化学分化过程是迅速、短暂、可逆的,且对细胞有损伤,因此,化学诱导后的BMSCs不适宜做细胞疗法的种子细胞。     

Long-Term Culture of Human Bone Marrow Stromal Cells in the Presence of Basic Fibroblast Growth Factor

Abstract

Basic fibroblast growth factor (bFGF) is a potent mitogen for human bone marrow stromal cells. Normally, large numbers of human bone marrow stromal cells are difficult to obtain. However, nanogram/ml concentrations of bFGF stimulate the growth of passaged bone marrow stromal cells both in media formulated for optimal growth of stromal cells and in a simple mixture of RPMI-1640 and 10% fetal calf serum facilitating the successive expansion of stromal cells through multiple passages. bFGF also greatly accelerates the formation of a primary stromal cell layer following inoculation of newly harvested bone marrow cells into dishes. In the presence of bFGF, the stromal cells attain high densities, lose their contact inhibition and grow in multilayered sheets. Heparin greatly potentiates the stimulatory effect of low concentrations of bFGF. The effects of bFGF are fully reversible: cells cultured in the presence of this factor for multiple passages revert to normal growth rates following trypsinization and subculture. A short (4 h) exposure of the cells to bFGF elicits profound growth stimulation. This supports the hypothesis that this factor binds to glycosaminogly-cans in the cell matrix which act as a storage reservoir for this cytokine.     

兔骨髓成骨细胞同种异体移植免疫反应的初步观察

以观察新生兔骨髓诱导分化为成骨细胞的能力 ,探讨同种异体成骨细胞移植的可行性 ,为进一步的研究奠定基础。取新生新西兰大白兔胫骨骨髓 ,分离后加入条件培养液体外培养。传 5代后对细胞进行形态学、碱性磷酸酶 (ALP )染色及体外矿化能力的检测。将冻存复苏的细胞以明胶海绵吸附 ,植入异体成年兔皮下、肌肉内 ,第 2、 4、 8、 12周时取材观察 ,分析其成骨能力及免疫排斥反应情况。结果显示体外诱导培养的骨髓成骨细胞是一较纯的细胞系 ,以带突起的梭形细胞为主 ,ALP染色阳性 ,连续培养 4 0d可见矿化结节形成。异体植入的成骨细胞大部分存活 ,4周后开始有类骨基质形成 ,并可见不规则的矿化骨组织 ,植入细胞周围仅见少量的淋巴细胞和嗜酸粒细胞浸润。骨髓基质细胞具有多向分化的潜力 ,异体植入的细胞仍保持基本的生物学功能 ,免疫排斥反应比较轻微 ,提示细胞异体移植是可行的     

人间充质干细胞表面标志物及特征

评价人间充质干细胞表面标志,对常见的表面标志物进行总结,认识HMSCs表面标志物生物学特性,为分离和鉴定HMSCs提供参考依据.检索2010至2016年PubMed数据库和中国知网数据库收录的与HMSCs表面标志物、生物学特性相关的文献.从细胞表面标记物的本质、实验结果等进行分析总结,总结了一些常见的HMSCs表面标志物.不同组织来源的HMSCs免疫活性可能与HMSCs处于不同组织中的活化状态、组织来源和培养条件的不同有关,从而导致不同源性HMSCs免疫活性也不完全相同,其表面标志物存在差异.利用杂交瘤技术制备的抗体,可将不同来源、不同阶段、不同培养条件的HMSCs分为不同的亚群.不同来源或不同分化阶段的HMSCs表面标记物存在差异.     

力学刺激诱导骨髓间充质干细胞选择分化的研究进展

机体细胞／组织处于复杂的力学环境中，力学刺激对细胞的形态、发育和功能起着重要的调节作用。骨髓间充质干细胞的增殖、选择分化受多种力学因素的影响，而且力学刺激的大小、方式以及作用时间对骨髓间充质干细胞定向分化的调节作用不尽相同。作者就力学因素对骨髓间充质干细胞选择分化的调节作用进行简要的综述。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、胰岛素等诱导MSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。结果诱导培养4d后,细胞胞浆内开始出现细小脂滴,12 d后在可观察到大量细胞由长梭形变为圆形或多边形,胞浆内形成高折光性的脂滴,苏丹Ⅳ脂肪染色后显示克隆中心的细胞胞浆内大量的颗粒状红色脂滴形成。细胞爬片显示约有60%骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。结论大鼠骨髓间充质干细胞能进行体外分离培养并能诱导分化为脂肪细胞。     

表皮生长因子对骨髓间充质干细胞体外趋化的影响

目的观察表皮生长因子(EGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外趋化的影响,探讨EGF对BMSCs迁移影响的可能机制。方法密度梯度离心法分离BMSCs,体外培养、传代纯化。利用Transwell小室建立体外趋化迁移模型。分别观察0,25,50,75,150ng/ml浓度的EGF对BMSCs的体外趋化作用,以及加入EGF中和抗体后对BMSCs趋化作用的影响;应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测大鼠BMSCs有无表皮生长因子受体(EGFR)的表达。结果细胞迁移实验结果:EGF以浓度梯度(0,25,50,75,150ng/ml)依赖方式促进大鼠BMSCs的定向迁移,作用显著(P<0.05)。抗体中和后的迁移实验:75ng/ml的EGF对BMSCs的趋化作用可被EGF中和抗体明显减弱(P<0.01)。RT-PCR证实BMSCs表达EGFR。结论在体外,EGF以浓度依赖方式引起BMSCs的定向迁移,BMSCs表达EGF的受体EGFR。     

Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow and Adipose Tissue: Isolation,Characterization, and Differentiation Potentialities

Comparative study of cultured human bone marrow and adipose tissue (lipoaspirate) mesenchymal stem cells was carried out. The main morphological parameters, proliferative activity, expression of surface and intracellular markers of these cells were characterized. Flow cytofluorometry and histological staining showed that both cell types exhibited similar expression of CD105, CD54, CD106, HLA-I markers, were positively stained for vimentin, ASMA, collagen-1, and fibronectin, but not HLA-DR, CD117, and hemopoietic cell markers. The cells underwent differentiation into adipocytes and osteoblasts under appropriate conditions of culturing. Incubation under neuroinductive conditions led to the appearance of a cell population positively stained for type III β-tubulin (neuronal differentiation marker). __________ Translated from Kletochnye Tekhnologii v Biologii i Meditsine, No. 3, pp. 158–163, September, 2005     

Distinct Effects of RGD-glycoproteins on Integrin-Mediated Adhesion and Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells

The detailed interactions of mesenchymal stem cells (MSCs) with their extracellular matrix (ECM) and the resulting effects on MSC differentiation are still largely unknown. Integrins are the main mediators of cell-ECM interaction. In this study, we investigated the adhesion of human MSCs to fibronectin, vitronectin and osteopontin, three ECM glycoproteins which contain an integrin-binding sequence, the RGD motif. We then assayed MSCs for their osteogenic commitment in the presence of the different ECM proteins.As early as 2 hours after seeding, human MSCs displayed increased adhesion when plated on fibronectin, whereas no significant difference was observed when adhering either to vitronectin or osteopontin. Over a 10-day observation period, cell proliferation was increased when cells were cultured on fibronectin and osteopontin, albeit after 5 days in culture. The adhesive role of fibronectin was further confirmed by measurements of cell area, which was significantly increased on this type of substrate. However, integrin-mediated clusters, namely focal adhesions, were larger and more mature in MSCs adhering to vitronectin and osteopontin. Adhesion to fibronectin induced elevated expression of α₅-integrin, which was further upregulated under osteogenic conditions also for vitronectin and osteopontin. In contrast, during osteogenic differentiation the expression level of β₃-integrin was decreased in MSCs adhering to the different ECM proteins. When MSCs were cultured under osteogenic conditions, their commitment to the osteoblast lineage and their ability to form a mineralized matrix in vitro was increased in presence of fibronectin and osteopontin.Taken together these results indicate a distinct role of ECM proteins in regulating cell adhesion, lineage commitment and phenotype of MSCs, which is due to the modulation of the expression of specific integrin subunits during growth or osteogenic differentiation.     

Effect of Disturbed Plasma Oxidant Homeostasis on Hemopoietic Differentiation of Polypotent Bone Marrow Stem Cells in Mice Treated with Dipyridamole

The choice of hemopoietic differentiation by polypotent bone marrow stem cells was studied by morphological and chemiluminescent methods. This choice occurred on day 7 after heterotopic bone marrow transplantation and dipyridamole administration, under the effect of oxidative homeostasis imbalance in the plasma. Dipyridamole increased total antioxidant activity and 10-fold reduced the intensity of free radical oxidation. Disaggregation therapy with dipyridamole reduced platelet count in the peripheral blood and decreased total plasma antioxidant activity.     

骨髓干细胞动员后归巢梗死心肌的实验研究

目的初步探讨骨髓干细胞动员后归巢梗死心肌的可能机制。方法结扎Wistar大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)模型,用干细胞因子(SCF)动员骨髓干细胞,部分大鼠予激素干预治疗,另设AMI组为对照组(A组)。制模后24h杀死大鼠,取出心脏,免疫组化法了解归巢于梗死心肌的CD34细胞数量,心肌组织中炎症趋化因子基质细胞衍生因子(SDF-1)表达量,以及HE染色观察心肌组织学变化。结果应用SCF动员治疗后,AMI 动员组(A1组)大鼠梗死灶内SDF-1表达量明显大于AMI组和AMI 激素 动员组(A2组),同时AMI 动员组(A1组)大鼠梗死灶内CD34阳性细胞数量也明显大于另2组。而AMI 激素 动员组(A2组)的SDF-1表达量最少,其梗死灶内CD34阳性细胞数量也最少。AMI 动员组(A1组)大鼠心肌梗死程度轻,可见CD34阳性的幼稚心肌细胞样细胞。结论应用SCF动员AMI大鼠的骨髓干细胞后,其向梗死灶归巢的能力增强,较多CD34细胞迁移到缺血灶内,并向心肌细胞等分化。骨髓干细胞动员后,心肌梗死灶内SDF-1表达量上调是吸引骨髓干细胞归巢的可能机制之一。     

婴幼儿骨髓间充质干细胞体外培养及基本生物学特性的实验研究

目的 建立一种体外分离和培养婴幼儿骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的方法，并探讨其基本生物学特性。方法 麻醉、无菌条件下行胸骨穿刺抽取先天性心脏病婴幼儿骨髓3mL-5mL，经密度梯度离心获得单个核细胞（Percoll分离液，γ为1．073），接种入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，测定其生长曲线，流式细胞仪检测婴幼儿BMSCs表面标记，并观察其形态、贴壁率、集落形成能力和超微结构的变化。结果 培养的要幼儿BMSCs 3h-4h后开始贴壁，贴壁率为65％-80％；2d-3d可见集落形成；10d左右汇合90％以上。BMSCs随着传代次数增加集落形成率逐渐降低。培养期间细胞形态均一，基本上为梭形成纤维细胞样形态。婴幼儿BMSCs表面标记CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性，CD3、CD14、CD34、CD45、HLA-DR不表达。透射电镜观察，婴幼儿BMSCs具有BMSCs典型的超微结构。结论 成功地建立了一种体外分离培养先天性心脏病婴幼儿BMSCs的方法，获得的细胞形态均一，生长稳定，增殖较快，能为体外构建组织工程化先天性心脏病修复材料提供重要的种子细胞的来源。     

兔BMSCs体外培养及其向成骨细胞分化的实验研究

目的　探讨培养兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化,为骨组织工程研究提供种子细胞。方法　取 2月龄新西兰大耳白兔,麻醉后取骨髓,直接进行原代培养,传代后观察其生长特性,绘制生长曲线并加诱导液使其 向成骨细胞方向分化,并分别用钙钴法检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测钙结节,免疫组化染色检测Ⅰ型胶原,透 射电镜观察胞质中钙质成分。结果　原代培养中出现大量细胞克隆,传代后细胞呈旋涡状密集生长,加入诱导液 后细胞形态发生改变并向成骨细胞分化,胞质内见有呈黑色的碱性磷酸酶颗粒和Ⅰ型胶原反应产物,并见有多个 细胞形成的钙化结节,电镜下观察到胞质中含有许多基质小泡,几天内成骨细胞数可达1×106/L。结论　培养兔 骨髓基质干可向成骨细胞方向分化,作为骨组织工程的种子细胞。     

力学因素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

近年来,组织工程学领域发展突飞猛进,已被列为一种修复或再生许多组织和器官的方法。骨髓间充质干细胞具有良好的成骨向分化潜能,在骨组织工程领域中具有广阔的应用前景。骨髓间充质干细胞增殖和成骨向分化受多种力学因素的影响,且不同性质的力学刺激对其定向分化的调节作用不尽相同。目前,许多学者致力于深入探讨力学因素影响骨髓间充质干细胞成骨向分化的具体途径,但其调控机制尚未完全明确。本文综述及讨论力学因素对骨髓间充质干细胞所产生的增殖、定向成骨分化等生物学效应的影响及可能涉及的力化学信号转导通路作用机制,以期丰富研究思路     

MicroRNA-26a对人骨髓间充质干细胞成骨分化机制在修复骨缺损研究进展

人骨髓间充质干细胞是人体成骨分化的主要骨母干细胞来源,主导人的骨与软骨的再生与重建。近年在研究影响的影响因素上,microRNAs被报道其相关家族在骨髓间充质干细胞的分化过程中起着关键的调节控制作用,其中miRNA-26a在促进骨髓间充质干细胞成骨分化中起着关键作用。microRNA-26a通过影响Smad1、GSK3β、BMP、Id1信号通路增强骨髓间充质干细胞的成骨分化作用,从而促进骨质生成。本综述将阐述microRNAs家族作用于成骨分化的发现,进一步详细阐述microRNA-26a对人骨髓间充质干细胞的作用机制的研究发现和目前miRNA-26a转染骨髓间充质干细胞对修复骨缺损的研究进展。     

大鼠骨髓基质细胞表面抗原CD71、CD44和CD45的检测

目的研究表面抗原CD71、CD44和CD45在体外培养的大鼠骨髓基质细胞的表达,了解骨髓基质细胞的生物学特性。方法采用全骨髓法分离培养大鼠骨髓基质细胞,待原代培养的细胞达70%以上汇合时,用含胰酶和EDTA的消化液消化细胞,进行传代培养。传至第3代(P3)的骨髓基质细胞采用流式细胞术检测表面抗原CD71、CD44和CD45的表达,专用配套软件计算细胞表面抗原阳性%率。结果骨髓基质细胞呈纺锤形、成纤维细胞样生长,漩涡状分布。传至第3代的细胞形态趋于一致。流式细胞仪检测结果显示,CD71、CD44和CD45阳性细胞百分比分别为99.07±7.6%、52.81±7.3%和10.85±5.0%。结论P3的骨髓基质细胞具有较强的增殖特性。