转染连接蛋白基因对人脑胶质瘤细胞间隙连接通讯及其生长变化的研究

目的 研究连接蛋白（Cx)基因对人脑胶质瘤细胞的细胞间隙连接通讯（GJIC）及其增殖的抑制作用,探索以Cx43基因治疗胶质瘤的可行性。方法 将含Cx43cDNA的质粒,以脂质体介导转染Cx43表达缺失的TJ905人胶质母细胞瘤细胞,通过Northern印染杂交、原位杂交及免疫组化染色检测Cx43mRNA及蛋白表达,划痕标记荧光染料示踪技术（SLDT）检测GJIC,MTT法测定细胞增殖率,核仁组成区嗜银蛋白（AgNOR)染色检测细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡。结果 转染后TJ905细胞有不同程度的Cx43mRNA和蛋白表达及GJIC恢复。Cx43表达水平高的克隆细胞增殖明显下降,细胞凋亡并未增加。结论 Cx43基因及GJIC在恶性胶质瘤的发生发展过程中起重要作用,可能成为恶性胶质瘤基因治疗的优选靶的之一。     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

人脑胶质瘤组织中锌指样转录因子4的表达及其对肿瘤细胞活性的影响

目的:探讨人脑胶质瘤组织中锌指样转录因子4（KLF4）的表达及其对肿瘤细胞活性的影响。方法:收集2018年3月至2019年5月河南省南阳市第二人民医院收治的74例初发恶性胶质瘤患者术中切除的胶质瘤组织标本,收集同期手术切除的50例良性脑膜瘤组织,以及31例因头部外伤手术切除的正常脑组织。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-...     

RNA干扰介导EphB4基因表达下调对胶质瘤细胞系U251生长的影响

目的：探讨靶向EphB4基因的小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对胶质瘤细胞EphB4 mRNA表达及细胞生长的影响。方法：体外化学合成针对人EphB4出基因的小干扰RNA并转染恶性胶质瘤U251细胞系后，RT-PCR法检测EphB4 mRNA表达的变化，CCK-8检测法观察RNA干扰对肿瘤细胞增殖活性的影响，FCM检测细胞周期变化，划痕实验观察细胞的迁移能力，采用Transwell小室穿膜细胞的数量来反应细胞的侵袭能力。结果：U251细胞转染siRNA-EphB4 100nmol／L后，EphB4 mRNA的表达水平下降了75．0％，细胞增殖抑制表现为剂量依赖性，FCM检测与阴性对照相比，细胞周期不同程度阻滞于亚G。期；并且细胞的迁移能力与对照组比较有所下降，Transwell小室穿膜细胞与对照组比较明显减少。结论：siRNA—EphB4能够明显靶向并抑制U251细胞中EphB4基因的表达，而EphB4基因表达下调可使U251细胞增殖受到影响，细胞周期出现凋亡峰。转染siRNA-EphB4后U251细胞的迁移和侵袭能力受到不同程度的抑制。提示抑制EphB4基因表达有可能成为胶质瘤治疗的新方法。     

外源性RGS16基因稳定转染对胶质瘤C6细胞生长的影响

背景与目的:有研究表明野生型p53可以诱导RGS16表达,而RGS16可能与胶质瘤的发生有关。本研究旨在探讨RGS16基因转染对大鼠胶质瘤C6细胞生长的影响。方法:构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RGS16,脂质体法转染C6细胞,经G418筛选后荧光显微镜观察细胞中增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorscentprotein,EGFP)的表达,RT-PCR证实RGS16的mRNA表达,免疫细胞化学方法检测细胞中RGS16蛋白表达。最后利用流式细胞仪、生长曲线、平板克隆形成等方法研究RGS16基因对胶质瘤细胞周期、生长及增殖的影响。结果:成功构建了稳定表达RGS16和表达空载体的细胞系C6-RGS16、C6-GFP。C6-RGS16、C6-GFP和C6经流式细胞仪检测S期的细胞比例分别为28.5%、18.9%和14.3%(P<0.05);生长曲线表明C6-RGS16生长的速度明显快于C6-GFP及C6,但其平板克隆形成率分别为12%、25%和25%(P<0.05)。结论:RGS16促进C6细胞周期从G1期向S期过渡,加快细胞生长速度,但是并不促进细胞克隆形成。     

Axin基因的表达对神经胶质瘤细胞系C6生物学特性的影响

目的研究Axin基因对神经胶质瘤细胞C6生物学特性及相关蛋白的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长曲线,应用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期的变化,并用平板克隆形成实验对细胞克隆形成能力进行了检测。应用末端TdT酶标记技术(TUNEL)观察细胞凋亡及比率。采用免疫细胞化学染色法检测Ki67、CyclinD1、p53的表达。结果转染Axin基因使细胞周期在G1期阻滞;细胞增殖能力和细胞克隆形成能力均显著降低;细胞凋亡率增高;Ki67及CyclinD1低表达,p53高表达。结论转染Axin基因后胶质瘤细胞出现了一定的增殖抑制现象,诱导细胞凋亡,Axin基因可能通过上调p53基因表达和下调Cy-clinD1表达而抑制胶质瘤细胞的生长。     

协同刺激分子程序性死亡受体1及其配体1在脑胶质瘤中的表达及其临床意义

目的探讨协同刺激分子程序性死亡受体1(PD-1)及程序性死亡受体配体1(PD-L1)在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义。方法收集2013年1月至2017年12月长治医学院附属和济医院70例脑胶质瘤术后蜡块标本及35例正常脑组织蜡块标本。采用免疫组织化学SP法检测PD-1、PD-L1在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达。分析两者表达与患者临床病理特征之间的关系以及PD-1、PD-L1两者在胶质瘤组织中表达的相关性。结果PD-1、PD-L1在胶质瘤组织中的阳性表达率分别为69%(48/70)、62%(43/70),均高于其在正常脑组织中的阳性表达率[29%(10/35)、31%(11/35)],差异均有统计学意义(χ2值分别为15.099、8.407,均P<0.05)。高级别胶质瘤中PD-1、PD-L1的阳性表达率分别为81%(30/37)、73%(27/37),均高于低级别胶质瘤中的阳性表达率[55%(18/33)、49%(16/33)],差异均有统计学意义(χ2值分别为5.699、4.415,均P<0.05)。不同性别、年龄、肿瘤最大径分层患者间PD-1、PD-L1阳性表达率差异均无统计学意义(均P>0.05)。胶质瘤组织中PD-1与PD-L1蛋白的表达呈正相关(r=0.372,P=0.002)。结论PD-1、PD-L1可能在胶质瘤的发生、发展过程中相互作用,有望成为评估胶质瘤发生、发展的生物学新指标。     

PIAS3绿色荧光蛋白表达载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建PIAS3绿色荧光蛋白真核表达载体,探讨外源性PIAS3对胶质瘤细胞U251周期和凋亡的影响。方法：利用RT-PCR扩增人全长PIAS3编码序列,并将其克隆到带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,得到重组质粒pEGFP-N1-PIAS3。应用脂质体法转染体外培养的人胶质瘤U251细胞株。荧光显微镜观察蛋白表达,用RT-PCR和Westernblot检测PIAS3的表达,Annexin V2FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞增殖周期变化。结果：转染PIAS3基因的细胞株外源目的基因和蛋白表达增强,瞬时转染48 h后,光镜下可见部分细胞变圆,部分细胞脱落死亡;对照组和未转染组无明显变化。流式细胞仪分析显示,pEGFP-N1-PIAS3转染组凋亡细胞增多,细胞凋亡率显著高于未转染组和pEGFP-N1转染组,P=0.0073;U251细胞转染pEGFP-N1-PIAS3后细胞周期阻滞于S期,S期细胞比例增高,P=0.025,G2期细胞比例降低。结论：外源性PIAS3使U251阻滞在S期,诱导胶质瘤细胞凋亡。     

外源型P14ARF基因对人脑胶质瘤细胞生长的影响

目的：研究Ｐ１４ＡＲＦ基因对人脑胶质瘤细胞株（Ｕ－２５１）生长的影响。方法：用脂质体介导携带Ｐ１４ＡＰＦ的真核表达载体转染Ｕ－２５１细胞,观察其对该细胞株的生长、增殖周期等生物学行为的影响。结果：导入Ｐ１４ＡＰＦ胶质瘤细胞Ｕ－２５１的生长有明显的抑制作用。     

胶质瘤与PDCD4的研究进展

PDCD4（ Programmed cell death 4）是近年来发现的与细胞凋亡相关的新的肿瘤抑制基因，研究发现PDCD4在多种肿瘤中存在缺失或下调，并影响肿瘤细胞的生物学行为。PDCD4是否是肿瘤细胞凋亡的关键因子？能否成为胶质瘤治疗的新的突破点？本文将围绕PDCD4最新研究进展，及其与胶质瘤的凋亡的相关性进行综述。     

过表达程序性细胞死亡基因5 提高脑神经胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性

[摘要] 目的：探讨抑癌基因程序性细胞死亡基因5（programmed cell death 5 gene, PDCD5）对脑神经胶质瘤细胞增殖及替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化疗敏感性的影响。方法：收集吉林大学第一临床医院神经外科2009 年1 月至2014 年12 月间收治的脑神经胶质瘤患者116 例。分别利用qPCR、WB及免疫组化方法检测神经胶质瘤细胞系U87、U251、稳定克隆U87-PDCD5 细胞、转染si-PDCD5 后的脑胶质瘤细胞以及原发性神经胶质瘤组织中PDCD5 mRNA及蛋白质的表达情况。MTT法检测过表达或敲降PDCD5 对胶质瘤细胞生长及TMZ化疗敏感性的影响。建立脑胶质瘤细胞系U87 裸鼠皮下荷瘤模型，随机分为对照组、TMZ组、PDCD5 组和TMZ+外源性PDCD5 重组表达载体联合组，治疗20 d 后断颈处死动物，切取瘤组织，测量瘤体积并称瘤质量。采用qPCR、WB 法检测移植瘤组织中PDCD5 的表达水平，分析PDCD5 联合TMZ 治疗对脑神经胶质瘤生长的影响。结果：PDCD5 mRNA和蛋白在U87 细胞中的相对表达量明显低于在U251 细胞中的相对表达量（均P<0.05）；在高级别脑神经胶质瘤组织中，PDCD5 mRNA和蛋白的表达明显低于低级别组织（均P<0.05）；U87-PDCD5 和U251 细胞对TMZ的敏感性均高于U87 细胞（均P<0.05），U87-PDCD5-siRNA、U251-siRNA 组细胞对TMZ的敏感性均明显低于对照组（均P<0.05）。比较裸鼠移植瘤的瘤体积和质量，对照组>TMZ组>PDCD5 组>联合组（均P<0.05）；各组移植瘤组织内PDCD5 mRNA及蛋白的表达水平趋势与之相反（均P<0.05）。结论：PDCD5 过表达可增强脑神经胶质瘤细胞对TMZ的化疗敏感性，而沉默PDCD5 表达作用则相反，PDCD5 与TMZ联合应用可更好地抑制脑神经胶质瘤裸鼠移植瘤的生长。     

miR-21靶向PDCD4调控非小细胞肺癌A549细胞的增殖与迁移

目的:探讨miR-21靶向程序性细胞死亡因子4(programmed cell death factor4,PDCD4)对非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)A549细胞增殖和迁移的影响及其作用机制.方法:采用脂质体转染技术分别将miR-21 mimics、miR-21inhi...     

miR-21调控程序性细胞死亡4基因的表达对宫颈癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨miR-21调控程序性细胞死亡4基因的表达对宫颈癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其 机制。方法:qPCR检测miR-21和PDCD4在宫颈癌组织中的表达情况;双荧光素酶实验检测miR-21和PDCD4之间的调控作用;细胞集落实验检测抑制miR-21对宫颈癌细胞增殖能力的影响情况,Transwell侵袭实验检测对宫颈癌细胞侵袭能力的影响情况。结果:与癌旁正常组织相比,miR-21在宫颈癌组织中的表达上调,PDCD4在宫颈癌组织中表达下调;双荧光素酶实验检测miR-21和PDCD4之间的调控关系,miR-21可直接调控PDCD4蛋白的表达及活性情况;抑制miR-21的表达后可以抑制宫颈癌细胞的增殖能力;抑制miR-21的表达水平后,宫颈癌细胞的侵袭能力得到一定程度的抑制。结论:miR-21可以调控PDCD4的表达影响宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。     

慢病毒介导的CIB1过表达对人脑胶质瘤细胞增殖和周期影响

目的 神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,其中恶性度最高的多形性胶质母细胞瘤现有的手术及放化疗等治疗方式对患者总体生存率无显著改善.本研究观察重组慢病毒中与肿瘤增殖、周期相关的钙整合素结合蛋白1(calcium-and integrin-binding protein 1,CIB1)基因,在人胶质瘤细胞系U251中的过表达情况及对其增殖和周期的影响.方法 PCR扩增CIB1目的片段,构建CIB1重组pLVX-IRES-CIB1-tdTomato慢病毒载体,将重组慢病毒表达载体感染293T包装细胞,进行病毒的包装并检测病毒滴度,筛选最佳病毒感染复数并感染U251胶质瘤细胞,荧光显微镜观察pLVX-IRES-CIB1-tdTomato慢病毒表达,CCK-8法检测CIB1过表达对人胶质瘤细胞增殖的影响,流式细胞仪检测CIB1过表达对细胞周期的影响.结果 成功构建慢病毒表达载体pLVX-CIB1-IRES-tdTomato,制备了重组CIB1慢病毒和空载体慢病毒,病毒滴度分别为2.9×107和2.8×107 ifu/mL;用最佳病毒感染复数100感染U251细胞.CCK-8检测显示,CIB1感染组与空载体对照组及空白组相比明显促进细胞增殖(P＜0.05),提示CIB1过表达对人脑胶质瘤细胞U251有生长促进效应.流式细胞检测显示,CIB1感染组U251细胞G2/M期细胞百分比明显增加,S期细胞比例下降.结论 CIB1过表达可以促进U251细胞增殖,并使细胞G2/M细胞比例上升.     

抑癌基因PDCD4与肿瘤关系的研究进展

程序性细胞死亡4(programmed cell death 4,PDCD4)是近年来发现的与细胞凋亡相关的新肿瘤抑制基因。研究发现PDCD4在多种肿瘤中存在缺失或下调,并影响肿瘤细胞的生物学行为。本文从该基因的发现、与肿瘤发生、发展的关系以及作用机制进行了综述。     

The neuro-steroid, 3beta androstene 17alpha diol exhibits potent cytotoxic effects on human malignant glioma and lymphoma cells through different programmed cell death pathways

The neuro-steroids 3beta-androstene-17alpha-diol (17alpha-AED), 3beta-androstene-17beta-diol (17beta-AED), 3beta-androstene-7alpha,-17beta-triol (7alpha-AET) and 3beta-androstene-7beta,-17beta-triol (7beta-AET) are metabolites of dehydroepiandrosterone and are produced in neuro-ectodermal tissue. Both epimers of androstenediols (17alpha-AED and 17beta-AED) and androstenetriols (7alpha-AET and 7beta-AET) have markedly different biological functions of their chemical analogue. We investigated the cytotoxic activity of these neuro-steroids on human T98G and U251MG glioblastoma and U937 lymphoma cells. Proliferation studies showed that 17alpha-AED is the most potent inhibitor, with an IC(50) approximately 15 microM. For T98G glioma, 90% inhibition was achieved with 25 muM of 17alpha-AED. Other neuro-steroids tested only marginally suppressed cell proliferation. Reduced cell adherence and viability could be detected after 18 h of 17alpha-AED exposure. Treatment with 17alpha-AED induced a significant level of apoptosis in U937 lymphoma cells, but not in the glioma cells. Cytopathology of 17alpha-AED-treated T98G cells revealed the presence of multiple cytoplasmic vacuoles. Acridine orange staining demonstrated the formation of acidic vesicular organelles in 17alpha-AED-treated T98G and U251MG, which was inhibited by bafilomycin A1. These findings indicate that 17alpha-AED bears the most potent cytotoxic activity of the neuro-steroids tested, and the effectiveness may depend on the number of hydroxyls and their position on the androstene molecule. These cytotoxic effects may utilize a non-apoptotic pathway in malignant glioma cells.     

Anxa5真核表达质粒构建及其对小鼠肝癌Hca—P细胞增殖影响观察

目的：构建pcDNA3。1-V5／HisB—Anxa5真核表达质粒,获得膜联蛋白A5（AnnexinA5,Anxa5）表达稳定上调的小鼠肝癌Hca—P细胞株,探究Anxa5上调对Hca—P增殖的影响。方法：利用RT—PCR扩增小鼠全长Anxa5编码序列,将其克隆到pcDNA3．1-V5／HisB载体中,并将构建的pcDNA3．1-V5／HisB-Anxa5表达质粒转入Hca—P细胞。采用（;418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,观察细胞形态变化。蛋白质印迹法分析Anxa5表达情况,CCK-8法检测相应Hca—P细胞的增殖能力。结果：酶切及测序结果显示,pMD R 18-T—Anxa5克隆质粒和pcDNA3．1-V5／HisB-Anxa5表达质粒构建成功;获得了Anxa5表达稳定上调的单克隆细胞株;与正常Hca-P比较,Anxa5蛋白在pcDNA3．1一V5／HisB-Anxa5-Hca-P单克隆细胞中上调了59．5％,P一0．016;pcDNA3．1-V5／HisB～Anxa5-Hca—P增殖显著加快,P=0．002。结论：成功构建了Anxa5真核表达质粒并获得Anxa5表达稳定上调的小鼠肝癌Hca—P细胞株,Anxa5上调对Hca—P细胞的增殖具有促进作用,为后续研究提供实验基础。     

The effect of transfected Cx43 gene on the GJIC and proliferation of glioma cells

Cell to cell communication via gap junction plays an important role in the maintanence of normal cell growth. Its disruption may lead to aberrant cell growth and eventually development of tumors[1]. Gap junctions (GJ) are specialized intercellular channels between plasma membrane of two adjacent cells. Each GJ channel is composed of two connexons contributed by each of two communicating cells and each connexon is a hexameric assembly of protein subunits known as connexins (Cx). Cx genes fun…