阳春砂实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选稳定表达的内参基因,用于阳春砂不同发育时期的果皮和种子团中基因表达量实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测的校正。【方法】以阳春砂3个不同发育时期的果实(分为果皮和种子团)为材料,根据高通量测序得到的转录组和表达谱数据,选择5个表达稳定的常用内参基因β-actin、EF-1α、GAPDH、PGK和TUA作为候选基因,并利用qPCR技术检测它们在不同样品中表达水平的变化,使用GeNorm和NormFinder软件对基因的稳定性进行分析。【结果】5个内参基因在不同发育时期的果皮和种子团中的表达稳定性有明显的差异,其中GeNorm分析得到的内参基因的稳定顺序为:EF-1α=TUAPGKGAPDHβ-actin,NormFinder的分析结果中稳定性最好的是EF-1α,其次为TUA,其他3个内参基因稳定性的排列顺序与GeNorm软件的结果一致。【结论】可选用EF-1α和TUA作为阳春砂果实发育过程中基因表达量差异分析的双内参基因。     

阳春砂1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆阳春砂萜类生物合成途径的上游关键酶——1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reducto iso merase,DXR)(EC:1.1.1.267)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。【方法】通过基于逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从阳春砂叶片中获得编码DXR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。【结果】获得了全长1749bp的编码阳春砂DXR的cDNA序列,命名为AvDXR1(GenBank登记号:FJ459894)。AvDXR1编码的蛋白与其他植物来源的DXR有很高相似性,含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)结合基序和DXR活性位点基序,N-端有叶绿体靶向转运肽。保守功能结构域的分析结果表明AvDXR1属于1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶家族。AvDXR1在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。【结论】AvDXR1基因是阳春砂DXR的编码基因,该基因在阳春砂的叶、茎、根、果皮和种子团中广泛表达。     

阳春砂仁不同部位挥发性成分的GC-MS分析研究

目的:对阳春砂仁种子团、果皮及根茎的挥发性成分进行分析比较,为砂仁资源的开发利用以及药效各异性提供理论依据。方法:冷冻干燥新鲜阳春砂仁的果实和根茎,水蒸气蒸馏法提取干燥种子团、果皮以及根茎的挥发油,气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析挥发性成分,按面积归一化法确定各成分的相对百分含量。结果:从挥发性成分中总共分析鉴定了120种组分,包括种子团30种、果皮63种、根茎70种,三者共有成分仅有10种;种子团和果皮中酯类成分百分含量最高,分别为52.5%、42.09%;根茎中的烃类成分含量最高,为39.32%;种子团、果皮和根茎的挥发性成分组成中,乙酸龙脑酯的含量分别为52.46%、40.35%和18.34%。结论:阳春砂仁种子团、果皮及根茎挥发性成分的组成和含量差异较大,为三者的药效各异性以及根茎和果皮的资源再利用提供直接的理论依据。     

阳春砂基于转录组的萜类合酶基因挖掘及一个单萜合酶基因的克隆

【目的】深入挖掘阳春砂转录组中挥发性萜类合酶相关基因,为全面认识阳春砂挥发性萜类代谢途径和分子调控模式奠定基础。【方法】整理前期工作获得的阳春砂2个转录组的数据,筛选已注释的及利用本地blast方法再注释的萜类合成途径的unigene;并通过对部分候选unigene的表达量与挥发性萜类化合物含量的相关性分析及生物信息学分析,进一步筛选出相关基因;采用PCR及重组载体构建的方法克隆其中一个单萜合酶基因,并对其编码蛋白序列进行分析。【结果】筛选得到10个挥发性萜类合成上游途径相关unigene及11个下游萜类合酶基因;相关性分析证明候选基因与阳春砂主要挥发性萜类有较强相关性;并成功克隆得到Av TPS1基因,其序列包含1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸;其编码蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序,N端含有一段叶绿体转运肽;系统进化分析表明Av TPS1属于TPS-b亚家族。【结论】结合转录组、表达谱数据的深入挖掘和与挥发性萜类化合物数据的关联,有效筛选出了阳春砂多个值得后续研究的萜类合酶基因;其中对Av TPS1的克隆及生物信息学分析为后续功能鉴定提供了基础。     

道地产区不同栽培品种阳春砂果实与花形态特征调查与分析

【目的】开展阳春砂高产优质新品种的认定,根据花与果实的形态方面特征为阳春砂的品种认定提供依据。【方法】对阳春砂道地产区（广东省阳春市）的阳春砂品种进行调查,对2个主要栽培品种“长果”、“圆果”和选育中品种“春选”的果实形态性状、花形态性状进行测量和统计。【结果】筛选出不同栽培品种间具有显著性差异的性状。【结论】道地产区阳春砂不同栽培品种在果实和花的形态上具有各自可区别的显著特征。     

不同发芽条件对阳春砂种子发芽的影响

【目的】比较不同发芽条件及赤霉素引发对阳春砂种子发芽的影响。【方法】以阳春砂种子为材料,比较光照条件、不同发芽床(基质)、不同培养温度对种子萌发的影响;以不同浓度赤霉素(GA3)处理,观察外源激素对阳春砂种子萌发的影响。【结果】(1)阳春砂种子的萌发需要光照。(2)种子在湿润滤纸上的发芽率和发芽势明显优于MS培养基。(3)25℃～30℃培养有利于种子的萌发。(4)400 mg/L的GA3引发有利于促进阳春砂种子的萌发,缩短发芽时间。【结论】适合阳春砂种子萌发的温度范围为25℃～30℃,在湿润滤纸上进行光照培养,并用400 mg/L GA3引发,有利于快速获得大量阳春砂苗。     

砂仁及其伪品的鉴别

砂仁为名贵常用中药材。我国药典规定，药用砂仁有阳春砂和海南砂两种，其植物来源为姜科豆寇属植物阳春砂Amomum villosum Lour、或海南砂Amomum Longiligulare T．L．Wu的干燥成熟果实。近年来，在砂仁中常发现掺入混淆品及伪品，主要来源于姜科植物Amomum和Alpinia属多种植物的果实和种子团，主要有：艳山姜Alpiniazerumbet（Pres．） Burtt et Smith的果实。     

阳春砂DXR超表达提高转基因烟草DXR活性及光合色素含量

【目的】筛选阳春砂1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)(AvDXR)转基因烟草T1代植株,鉴定AvDXR基因在模式植物烟草中的功能。【方法】采用抗生素、聚合酶链反应(PCR)法筛选转基因烟草T1代植株;采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法分析目的基因在T1代转基因烟草中的表达情况,采用分光光度法测定酶活性和光合色素含量。【结果】经过抗生素筛选和PCR检测获得AvDXR基因稳定遗传的转基因烟草T1代;AvDXR在部分T1代植株中得到超表达;经测定超表达植株中的DXR活性和光合色素含量均有提高。【结论】AvDXR超表达提高了转基因烟草DXR活性和光合色素含量,获得的AvDXR超表达植株可作为进一步分析萜类成分的材料。     

阳春砂种子蛋白质提取方法的探索

【目的】探索适用于阳春砂种子蛋白质的提取方法,为研究阳春砂种子休眠与萌发过程中的差异蛋白质组学奠定基础。【方法】分别采用4种较常用的蛋白质提取方法[Tris-HCl提取法、三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法、直接裂解法以及改良Tris-饱和酚法]提取,对得到的蛋白质提取液进行定量及十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析。【结果】直接裂解法蛋白质提取率最大,小分子蛋白较多; Tris-HCl法提取率最小,且条带扩散; TCA-丙酮沉淀法和改良Tris-饱和酚法提取率居中,但是TCA-丙酮沉淀法条带少,饱和酚法条带多,且可以得到大分子蛋白。【结论】可以综合直接裂解法和改良Tris-饱和酚法,为阳春砂种子双向电泳的蛋白质提取方法提供参考。     

砂仁及其伪品的鉴别

砂仁为名贵常用中药材。我国药典规定,药用砂仁有阳春砂和海南砂两种,其植物来源为姜科豆寇属植物阳春砂Amomum villosum Lour.或海南砂Amomum Longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实。近年来,在砂仁中常发现掺入混淆品及伪品,主要来源于姜科植物Amomum和Alpinia属多种植物的果实和种子团,主要有:艳山姜Alpinia zerumbet(Pres.)Burtt et Smith的果实。福建土砂仁,为植物山姜Alpinia japonica(Thunb.)Miq.的果实。姜科植物长序砂仁Amomum thyrsoideum Gagnep的干燥成熟果实。海南假砂仁Amomum chinense Chen ex T.L.Wu的果实。瘤果豆…     

水杨酸、对甲氧基苯甲酸和甲硝唑的拉曼光谱

目的研究水杨酸、对甲氧基苯甲酸和甲硝唑等化合物拉曼光谱的波长选择性。方法分别采用近红外、可见和紫外区3种波长的激光激发获得不同的拉曼光谱,受照样品包括水杨酸、对甲氧基苯甲酸以及临床常用药物甲硝唑。结果水杨酸、对甲氧基苯甲酸的水溶液在可见和近红外激发下无法获得任何拉曼信息,但在紫外激发下可获得信息丰富的拉曼光谱,且与其固体拉曼谱对应良好。而甲硝唑在紫外激发下没有明显的拉曼峰但在近红外和可见光激发下能获得一致的拉曼信息。结论水杨酸、对甲氧基苯甲酸水溶液的拉曼光谱证明了紫外激发的优越性,甲硝唑的拉曼光谱提示样品对激发波长的选择性。     

HPLC法测定四酸粉中水杨酸和苯甲酸的含量

目的：建立HPLC法测定四酸粉中水杨酸和苯甲酸的含量。方法：采用C18色谱柱（150×4.6mm,5μm）,以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.2）-甲醇（60：40）为流动相,柱温25℃,流速为1.0mL/min,检测波长为225nm,进样量为20μL。结果：线性范围分别为水杨酸14.226～33.194μg/mL,r=0.9998,苯甲酸7.278～16.982μg/mL,r=0.9999;平均回收率为水杨酸100.6%（RSD=0.50%）,苯甲酸100.6%（RSD=0.15%）。结论：本文方法简便,快速,准确,可作为本品质量评价和生产工艺监控的有效方法。     

中和法制备水杨酸微晶

为增加水杨酸在各类制剂中的分散度，便于制备，提高疗效，采用酸碱中和法将其制成微晶。先将水杨酸与１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠反应成盐溶解，然后用１ｍｏｌ／Ｌ盐酸中和析出微晶。所得微晶呈针状，色白，膨松，在电镜下测得平均粒径为１６μｍ。各项理化标准符合中国药典１９９５年版规定。本法微晶得率为９８％。     

氨基甙类抗生素的耳毒性及其水杨酸制剂的防护作用

氨基甙类抗生素(AmAn)因具有广谱抗菌性和价格便宜等特点而被广泛应用于临床,但研究证实其具有严重的耳毒性不良反应。水杨酸制剂能有效防护AmAn的耳毒性。本文将对AmAn的耳毒性以及水杨酸制剂发挥防护作用的研究进展予以综述。     

原料药乙酰水杨酸中水杨酸的流动注射光度分析法

基于水杨酸在ｐＨ２的盐酸介质中与Ｆｅ＾３＋生成紫色络合物，在５２０ｎｍ处有强吸收，而乙酰水杨酸无干扰的原理，建立了流动注射光度法测定原料药乙酰水杨酸中杂质水杨酸的含量，方法快速、简便。在０．０１￣０．２０ｍｇ／ｍｌ浓度范围内线性关系良好，方法回收率为１０１．５％。     

聚吡咯修饰电极间接测定药物中乙酰水杨酸含量

用聚吡咯修饰电极间接测定了正痛片中乙酰水杨酸的含量,讨论了该方法可行性。用该电极测定正痛片中乙酰水杨酸的结果表明,此法测定速度快,重现性好,避免了在萃取过程中乙酰水杨酸的消耗。     

荧光分光光度法测定水杨酸的含量

本文探讨了用荧光分光光度法测定复方水杨酸制剂中水杨酸含量的方法,采用激发波长302nm,发射波长406nm。结果,线性范围0.5～4μg/ml,相关系数γ=O.9997,制剂中水杨酸的平均回收率为99.5～101.6％。变异系数CV0.73～2.30％,并且在该波长下,制剂中的苯甲酸、冰醋酸以及色素等均不影响水杨酸的定测。     

水杨酸糖酯制备及活性研究

目的:制备水杨酸糖酯,考察其刺激性和生物活性.方法:用羧酸有机碱法制备水杨酸糖酯;用1H-NMR和IR确认结构;用小鼠断尾法和小鼠耳肿胀法评价抗凝血活性和抗炎活性,组织切片法观察刺激性.结果:合成了4个β-构型的水杨酸糖酯,其中有3个的抗炎作用与阿司匹林相当,1个的抗凝血活性高于阿司匹林;合成物的刺激性均小于原药.结论:水杨酸糖酯类修饰可以降低刺激性.     

人参毛状根转化水杨酸研究

目的：利用人参毛状根作为有效的生物反应器,对水杨酸进行结构改造。方法：培养人参毛状根22d,外源加入0．1mmol·L^-1水杨酸后,连续培养48h,利用TLC、HPLC等方法鉴定,分析转化物清除自由基能力。结果：人参毛状根中有新化合物产生,化学鉴定试验结果提示水杨酸的酚基被糖基化生成相应的糖苷。结论：水杨酸转化后人参毛状根醇提物能够清除活性氧自由基,具有良好的应用前景。     

水杨酸—尿素固体分散体系的研究

某些难溶固体药物能和适当的载体形成固体分散物,以减小药物粒度,提高药物溶出及吸收速率。水杨酸(Salicylic acid简称SA)和尿素(urea简称V)有形成同体分散物的性质。实验结果表明,SA含量22％的SA—V低共熔物中SA的溶解度约是纯SA的16倍,溶出量约是纯SA的68倍。由低共熔物制成的软膏,体外释放速率比纯SA软膏有较大提高。