构建shRNA慢病毒载体抑制U937细胞株VEGFR-1基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor 1, VEGFR-1）基因的siRNA前体表达载体．鉴定其对U937细胞株VEGFR—j基因干扰效率。方法体外设计并合成针对VEGFR-1基因的慢病毒shRNA干扰载体．通过PCR及测序证实载体构建成功。将慢病毒颗粒以最适滴度转染人单核白血病细胞株U937．应用Real—TimePCR、Western印迹法检测抑制效率。结果构建的慢病毒载体的序列通过PCR、测序等鉴定,与设计序列相同。Real—TimePCR检测显示U937细胞干扰组VEGFR-1mRNA表达率下降75．98％,Western印迹法显示U937细胞干扰组VEGFR-1蛋白表达量较空白载体对照组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制U937细胞株VEGFR—1基因的表达。     

NY-ESO-1抗原T细胞受体基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的慢病毒载体并获得重组慢病毒。方法设计特异性NY-ESO-1TCR的引物,用聚合酶链反应（PCR）对我们前期已克隆的NY-ESO-1TCRcDNA进行体外扩增,双酶切后定向插入到pCL20c-MSCV-GFP质粒,构建NY-ESO-1抗原特异性TCR基因的重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,并经酶切、PCR及测序鉴定。用pCL20c-MSCV-ESOTCR﹑pCL20c-HIV-gp、pCAG4-RTR2和CAG-VSV-G共转染T293包装细胞,获得上清,上清浓缩后感染Hela细胞,观察ESOTCR基因及蛋白水平的表达。结果经PCR及测序证实,成功构建重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,包装产毒后感染Hela细胞,RT-PCR法及荧光显微镜均能检测及观察到基因及蛋白水平的表达。结论成功构建了表达NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的重组慢病毒载体。     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。     

靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

信号转录激活子3基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建人信号转录激活子3（STAT3）基因shRNA慢病毒载体。方法：从GenBank STAT3 mRNA上寻找到3条有效靶序列,合成3对针对靶序列的siRNA oligo,通过筛选获得最佳靶序列后合成相应的shRNA模板,将合成好的两条互补的DNA单链退火形成双链DNA,经与BamH Ⅰ和Xho I酶切的pRNAT-U6.2/Lenti载体连接后产生shRNA慢病毒载体,酶切和测序鉴定。结果：酶切和测序鉴证实合成STAT3shRNA慢病毒载体寡核甘酸链插入正确。结论：成功构建人STAT3基因shRNA慢病毒载体。     

靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究.文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础. 方法 根据慢病毒表达载体酶切位点的特征序列设计PCR扩增引物并扩增人Bi-1cDNA,并采用DNA重组技术定向克隆至pLCMV-IG质粒中,构建重组慢病毒载体质粒pLCMV-IG-Bi-1,经PCR、双酶切和测序鉴定后,包装慢病毒感染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3中,RT-PCR及Western-blot 分别检测NIH3T3细胞中Bi-1基因和蛋白的表达. 结果 PCR、酶切及测序结果 表明重组慢病毒载体构建成功;NIH3T3细胞感染重组载体包装的慢病毒后出现明显的Bi-1基因高表达. 结论 成功构建靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体,为进一步研究Bi-1基因对细胞生长转化的影响提供了实验依据.     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。     

Smurf1基因靶向RNAi 慢病毒载体的构建及转染

目的构建Smad泛素调节因子1(Smurf1)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础。方法构建Smurf1基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4条RNAi片段并构建RNAi慢病毒载体。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western印迹法进行外源筛靶,筛靶出成功的干扰质粒PSC2939。用慢病毒包装PSC2939后感染U20S细胞,进行内源验证,荧光定量PCR和Western印迹检测U20S细胞中Smurf1mRNA及蛋白的表达。结果经PCR及测序证实,Smurf1基因过表达载体及4种干扰载体均成功构建;Western印迹外源筛靶显示,PSC2939干扰载体能有效敲减目的基因的表达;慢病毒包装后的PSC2939干扰载体能有效抑制U20S细胞中Smurf1蛋白的表达,对Smurf1mRNA的抑制率达到60%以上。结论成功构建可供感染的Smurf1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Smurf1基因在骨肉瘤细胞中的作用提供了有效的实验工具。     

针对IER3IP1基因的shRNA真核表达

目的:构建特异性针对IER3IP1基因的shRNA(Short Hairpin RNA)的真核表达载体,观察对IER3IP1基因表达的沉默作用,筛选出抑制效果较好的干扰片段.方法:针对IER3IP1基因,设计合成2对特异性DNA片段以及1对无关序列的阴性对照DNA片断,将它们插入真核表达载体pGenesil-1中构建重组质粒,质粒转染L02正常肝脏细胞株后,以半定量RT-PCR法检测转染后24、48、72 h IER3IP1基因的抑制效果.结果:成功构建2个特异性针对IER3IP1的shRNA真核表达载体;所构建的载体中有1对能够特异性的降低L02细胞中IER3IP1的mRNA表达水平,且干扰效果显著,抑制率较高,与空载对照组比在转染后24、48、72 h抑制率分别为64%、79%、69%.结论:设计构建的真核表达载体可以特异性干扰IER3IP1基因的表达,为进一步研究IER3IP1基因的功能奠定了基础.     

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定.方法:针对筛选确定的人STUB1 基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I 和EcoR I 酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA 慢病毒载体.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒.结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确.STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒.结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体.     

CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein-I,CRBP-1)基因RNAi(RNA interfer-ence,RNAi)慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论:成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi慢病毒载体。     

NMNAT1基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶.1(NMNAT1)基因慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法:将靶向NMNAT1基因连接到慢病毒载体pGC-E3/Lenti中,获得pGC-E3-NMNATI统一质粒,经PCR检测以及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过LipofectamineTM2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度.结果:PCR扩增和测序结果证实,Nmnatl核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1×105U/L.结论:成功构建NMNAT1基因慢病毒载体,为研究其在面神经损伤修复中的功能和基凶治疗奠定了基础.     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)通过保护肠黏膜屏障功能缓解炎症性肠病的作用

目的研究1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)通过保护肠黏膜屏障缓解炎症性肠病的作用。方法构建S1PR2基因敲除鼠。用硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导结肠炎。血清荧光素异硫氰酸酯(FITC)浓度测定体内外小鼠肠道渗透性。酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞悬液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果野生型(WT)小鼠存活率及体重高于S1PR2-/-小鼠,差异有统计学意义(P0.05)。S1PR2-/-小鼠的结肠缩短比WT小鼠更明显,差异有统计学意义(P0.05)。DSS处理组小鼠结肠细胞悬液中IFN-γ、IL-6和TNF-α浓度较对照组水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 S1PR2通过保护肠黏膜屏障功能缓解炎症性肠病。     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的：设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

CD146短发夹RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 CD146基因表达增高与涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)的临床症状相关.为进一步研究CD146基因的功能,构建人CD146短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并鉴定.方法 根据Genebank中靶基因CD146序列,按照Tuschl设计原则,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pGenesil-1载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定.结果 经过限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定,证实重组质粒pGe-CD146-shRNA的序列正确.结论 成功构建了靶向人CD146基因的shRNA真核表达载体系统,为进一步研究CD146基因的功能奠定了实验基础.