抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

抗人红细胞单链抗体基因的克隆与表达

目的：获得抗人红细胞单链抗体（single-chain antibody,ScFv)基因,并在大肠杆菌中表达具有能与人红细胞特异性结合的ScFv。方法：以从分泌抗人红细胞单克隆抗体细胞株中提取细胞的总RNA为模板,利用扩增鼠源性抗体可变区基因的通用引物,通用RT－PCR分别获得轻链（VL）、重链（VH）可变区基因,并通过15个氨基酸的加接肽（Gly4Ser)3按VL－接头－VH的顺序连接起来,组建成ScFv基因。结果：核苷酸序列分析证明,获得的单链抗体基因VH基因属于小鼠抗体重链可变区基因家族的V（A）组,VL基因属于小鼠抗体k轻链可变区基因家族的IV组。与PGEX－5X－3表达载体上的GST融合蛋白表达后,在相对分子质量54000有一明显的空载体对照没有的蛋白带（ScFv28000,GST26000）。间接免疫荧光证明该表达产物能与人红细胞特异性结合。结论：获得抗人红细胞ScFv基因和具有抗体活性的抗人红细胞ScFv,为建立患者自身红细胞凝集试验奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达

目的 构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv（dsFv）抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段。方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链（VH、VL）突变基因,NdeⅠ和NotⅠ双酶切后分别插入pET-22b（＋）表达质粒中,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达。将VL、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性,按比例混合在复性折叠缓冲液中,使二者折叠形成dsFv抗体片段。并以其母本抗体scFv作对照,对其抗原特异性和稳定性进行初步评价。结果 在VH的第44位氨基酸和VL的第100位氨基酸引入了半胱氨酸,成功构建了抗狂犬病毒dsFv抗体基因,并在原核系统中实现了对二者的高效表达,VH、VL蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了dsFv抗体片段。结论 对筛选获得的抗狂犬病毒scFv成功进行了稳定性改构,制备了有活性的dsFv抗体片段,改构以后的dsFv保持了对狂犬病毒的特异结合活性,而其在血清中的稳定性有明显改进,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人论著TNFα融合基因在CHO(dhf)细胞中的表达

目的 :提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子 (hScFv2 5 hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体 突变体人TNFα融合基因 (ds ScFv hTNFα) ,并在CHO细胞中表达。方法 :常规构建ds ScFv hTNFα融合基因 ,并克隆入真核表达载体pCI(dhfr1) ,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株 (CHO dhfr ) ,甲氨蝶呤 (MTX)高压筛选高表达细胞株 ,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果 :目的基因在CHO(dhfr )中获得了表达 ,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性 ,且稳定性得到大幅度提高 ,达到 4℃放置 4个月活性无明显下降。结论 :抗肝癌人源化ds ScFv hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达 ,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

功能未知基因LOC410296的表达载体构建及小鼠抗血清制备

目的：为深入研究功能未知基因LOC401296,首先获取其全长序列,实现LOC401296分子的真核和原核表达,并制备针对 LOC401296蛋白的抗血清。方法采用 PCR 方法克隆 LOC401296编码区全长序列,利用pET28B和pCMV-Myc质粒构建LOC401296原核表达和真核表达载体,用异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导目的蛋白原核表达,目的蛋白经纯化、复性后免疫小鼠制备抗血清。结果 PCR克隆得到LOC401296编码区全长序列,成功构建LOC401296原核及真核表达载体,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌体内表达,用纯化蛋白免疫小鼠获得抗人LOC401296蛋白血清, ELISA检测抗血清效价达1∶64000,Western印迹证实LOC401296真核表达载体成功表达且抗血清特异性良好。结论获得LOC401296基因编码区全长序列,成功构建了LOC401296基因表达载体,分别在大肠杆菌和真核细胞内实现LOC401296蛋白原核表达和真核表达,获得小鼠抗人LOC401296蛋白抗血清,为LOC401296基因功能研究奠定了基础。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体—突变体人TNFα融合基因在CHO（dhfr^—）细胞中的表达

目的：提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子（hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体－突变体人TNFα融合基因（ds-ScFv-hTNFα）,并在CHO细胞中表达。方法：常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfrl）,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO－dhfr^-）,甲氨蝶呤（MTX）高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果：目的基因在CHO（dhfr^－）中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降。结论：抗肝癌人源化ds-ScFv-hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备

目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）重要的外分泌毒力因子α-溶血素（alpha hemolysin, Hla）,检测Hla蛋白对不同种属红细胞的裂解作用;制备其特异性抗体,并检测抗体的中和活性。方法以SAU NCTC-8325菌株基因组为模板,PCR扩增hla基因,构建重组表达载体pET-28a-Hla,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,通过Ni2＋柱亲和纯化获得Hla蛋白;通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性。结果重组Hla蛋白以可溶形式表达,细胞裂解实验表明,纯化的Hla蛋白可以显著裂解兔红细胞,但人红细胞和羊红细胞对Hla杀伤作用不敏感。 ELISA结果表明,获得了效价较高的多克隆抗体。该抗体可以有效抑制Hla对兔红细胞的裂解作用。结论 SAU的Hla蛋白对不同种属红细胞的溶解能力不同,为探讨Hla裂解细胞的机制给予一定的提示;同时所制备的特异性抗体（ anti-Hla）可以抑制Hla的溶血作用,为深入研究Hla的致病机制奠定了基础。     

抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达

在本室构建的抗乙肝病毒表面抗原单链抗体表达载体pHBSCS的基础上,通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中,构建了单链抗体高效表达载体pT7SC.将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,获得ScFv的高效表达,经SDS-PAGE检测,表达产物占菌体总蛋白的28%以上.对IPTG诱导后的细菌培养上清进行竞争抑制性ELISA检测,证明所表达的ScFv具有抗体活性.     

人内皮抑素基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑制素蛋白。方法：从人胎肝中分离总RNA,经反转录聚合酶链反应（RT－PCR）得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建pBV220/endostatin重组质粒,经DNA测序确认后,将其转化大肠杆菌DH5a进行表达,初步纯化及活性测定。结果：经SDS－PAGE电泳分析表达产物分子量约20Kda,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的30％。结论：经生物学活性测定,表达蛋白能够抑制bFGF(碱性成纤维细胞生长因子）对牛毛细血管内皮细胞（BCEC）的增殖作用。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

牛结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的原核表达和纯化

构建牛结核分枝杆菌ESAT-6基因的原核表达载体,诱导表达、纯化并初步鉴定该蛋白。方法:以牛型分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR方法扩增ESAT-6基因,产物通过双酶切克隆入pET-22b(+)质粒,经PCR、酶切、测序等方法鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)polys菌体,经IPTG诱导表达蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果:所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现在6kDa处有特异性蛋白条带。纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论:成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a的克隆表达及其cDNA序列分析

目的：从丝瓜籽中克隆核糖体失活蛋白luffin-a基因，并在原核系统进行表达。方法：根据已报道的cDNA序列设计引物，用RT-PCR的方法从成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因，克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-28a（＋）-luffin-a，转化大肠杆菌BL21（DE3），并经IPTG诱导表达。利用金属离子亲和层析的方法纯化所得目的蛋白。结果：克隆的luffin-a基因及其所编码的氨基酸序列与国外报道的核苷酸序列及氨基酸序列同源性分别为95％和92％，因而所获得的luffin-a基因是丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a一个新的cDNA序列。经SDS-PAGE分析：luffin—a主要存在于包涵体中。金属离子亲和层析可纯化目的蛋白。结论：本研究成功地克隆了luffin-a一个新的序列，并建立了该蛋白的原核表达系统，同时利用亲和层析可一步法纯化获得目的蛋白。     

单链抗体—碱性磷酸酶检测系统的建立

目的：建立简便快速的单链抗体检测方法。方法：用PCR法和DNA重组技术构建了突变型碱性磷酸酶基因和单链抗体－突变型碱性磷酸酶融合基因;利用IPTG诱导融合基因的表达,并用pNPP底物液检测碱性磷酸酶的活性,用ELISA法检测和比较了不同单链抗体的相对活性。结果：实现重组突变型碱性磷酸酶基因在大肠杆菌中的功能性表达,且活性较重组野生型碱性磷酸酶活性高30倍左右。重组单链抗体－突变型碱性磷酸酶融合基因在大肠杆菌中获得功能性表达,周质中表达产物具有双功能,并成功地利用该系统分析了不同单链抗体的相对活性。结论：该单链抗体－碱性磷酸酶检测系统能够方便地应用于单链抗体的活性分析。     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK的克隆及原核表达

目的:探讨红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK在大肠杆菌中的最佳表达条件.方法:将eryK基因克隆到表达质粒pET-22b( ),使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并对装液量、接种量、诱导时间、IPTG浓度和FeCl3浓度等表达条件进行优化.结果与结论:SDS-PAGE电泳显示,在相对分子质量44×103处有EryK蛋白条带,其含量占菌体总蛋白的58%以上.证明高GC含量的红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因EryK可以在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达,为体外研究EryK酶学相关性质以及大规模发酵奠定了基础.     

红色糖多孢菌表达载体pZW的构建

目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率.方法:以pSET152和pET-22b( )为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW.结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP).结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因.     

A型肉毒毒素轻链多步纯化及其金属蛋白酶活性研究

目的：利用基因工程方法原核表达N－His标签的A型肉毒毒素轻链（ BoNT－ALC）蛋白,多步纯化获得高纯度蛋白,并对其金属蛋白酶活性进行鉴定。方法以A型肉毒毒素为模板,构建重组表达载体pET22b－ALC,转化BL21（DE3）,诱导蛋白表达,采用镍柱亲和纯化、阴离子交换以及分子筛纯化获取高纯度目的蛋白;通过体外切割特异性底物SNAP－25实验进行酶活性研究。结果与结论获得高纯度的BoNT－ALC蛋白,对金属蛋白酶活性进行了验证。该纯化方法获得的蛋白纯度高、均一性好,且具有很好的酶活性,为后续研究奠定了基础。